大鼠脂肪组织源间充质干细胞的培养及诱导分化 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 11:47 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：郭勇张西正魏严郭春李瑞欣徐晓莹张永红作者单位：军事医学科学院卫生装备研究所，天津  300161

   & D# B" L0 ~$ C& u. H
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      【摘要】  目的体外培养脂肪组织源间充质干细胞，诱导该细胞向成骨细胞和心肌细胞分化，为骨和心肌组织工程提供种子细胞。方法取Wistar大鼠脂肪组织，以胰蛋白酶消化分离出脂肪间充质干细胞。第三代细胞用于鉴定细胞表面抗原，同时以成骨诱导培养液诱导细胞，并以10 μmol/L 5  氮胞苷处理细胞24 h，然后培养，用免疫组化法和组织化学法检测这些细胞。结果所分离细胞90%以上表达CD44、CD13、CD29抗原，有些细胞表达肌节型肌动蛋白和结蛋白；经成骨诱导液诱导14 d的细胞表达碱磷酸酶，21 d后表达骨钙蛋白并有少量胞外钙沉积；经10 μmol/L 5  氮胞苷处理的细胞均表达NKx2.5、肌节型肌动蛋白和连接蛋白Cx43。结论本实验所培养的细胞为脂肪组织源性间充质干细胞，能向成骨细胞和心肌样细胞分化，可为骨和心肌组织工程提供种子细胞。
      【关键词】脂肪组织间充质干细胞分化成骨细胞心肌细胞组织工程
   Culture and Inducing Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Rat.GUO Yong，ZHANG Xi  zheng，WEI Yan，GUO Chun，LI Rui  xin，XU Xiao  ying，ZHANG Yong  hong.Space Medicine & Medical Engineering,2008,21(6):477～481$ z( d8 H5 H0 X
" S4 r, E6 X) ^5 {* r
Abstract: Objective To provide seed cells for bone and cardiac tissue engineering，adipose tissue  derived mesenchymal stem cells cultured in vitro and induced differentiation into osteoblast and cardiomyocyte  like cells. Methods The mesenchymal stem cells were  separated and cultured from the adipose tissue of Wistar rats with typsin digestion. The third passage cells were used to be induced differentiation and detected the surface antigens. Some cells were cultured with osteoinductive medium，the other cells were cultured with 10 μmol/L 5  Azacytidine for 24 h，then the cells were detected by immunohistochemical and histochemical method. Results More than 90% separated cells expressed CD44, CD13 and CD29 antigens. Some cells expressed α  sacromeric actin and desmin. Induced with osteoinductive medium for 14 d, cells expressed alkaline phosphatase. Induced for 21 d, cells expressed osteocalcin and a little extracelluiar calcium sediment appeared. After 14 d cultured with 10 μmol/L 5  Azacytidine，the cells were found to express NKx2.5,α  sacromeric actin and Cx43. Conclusion Mesenchymal stem cells can be obtained from adipose tissue by digestion method. These cells can be differentiated into osteoblast and cardiomyocyte  like cells to provide seed cells for bone and cardiac tissue engineering.

Key words:adipose tissue; mesenchymal stem cells; differentiation; osteoblasts;cardiomyocytes;tissue engineering* k7 d- y0 |! Q$ l$ |+ w" c

Address reprint requests to: ZHANG Xi  zheng. Institute of Medical Equipment,Academy of Military Medical Sciences，Tianjin  300161,China8 F; |0 V: R* d4 P0 L, b% N
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间充质是指胚胎发育过程中填充在外胚层和内胚层之间散在的中胚层组织,内含间充质细胞(mesenchymal cells),这些细胞分化程度低,不但能分化为多种结缔组织细胞,还能分化为内皮细胞和平滑肌细胞［1］,因此间充质细胞中的干细胞(有时也指间充质细胞)被称为间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)。

MSC的来源比较广泛，除了骨髓来源以外，在外周血、脐带血、皮肤、肌肉、关节滑膜等多种组织中均发现有MSC存在［2］。研究发现，脂肪组织中含大量具有多向分化潜能的脂肪组织来源的间充质干细胞（adipose tissue  derived mesenchymal stem cells,ADMSCs）。在体外培养条件下, ADMSCs表现出与骨髓来源的MSC相类似的分化能力。近几年来，国内外很多研究组分离培养ADMSCs并进行诱导分化，有的发现ADMSCs可向成骨细胞分化［3  4］，有的发现ADMSCs可向心肌样细胞分化［5  6］, ADMSC还可向其它多种细胞分化。因此，ADMSCs将成为一种重要的用于组织工程和细胞治疗研究的细胞。

国内外在ADMSCs的分离培养及诱导分化方面的研究还不够深入和全面，有的研究仅仅做了向一种细胞诱导分化的实验，对ADMSCs的特征没有进行深入鉴定和检测。本实验分离出大鼠ADMSCs并传代培养，对其特征进行鉴定和检测，并诱导同一大鼠的ADMSCs向成骨细胞和心肌细胞分化，检测其多向分化潜能，为将ADMSCs用于骨组织工程和心肌组织工程打下基础。3 P8 k& a5 w9 W; R& H8 w

方  法
6 Y9 W6 s, S9 \/ t5 X, A
实验材料

Wistar大鼠（二月龄，军事医学科学院动物中心），DMEM低糖培养基和胎牛血清（Gibco），兔抗NKx2.5、骨钙蛋白多抗（Santa cruz），兔抗CD13、CD44、CD29、连接蛋白Cx43多抗（武汉博士德公司），小鼠抗肌节型肌动蛋白单抗（武汉博士德公司），胰蛋白酶（Sigma），茜素红染色试剂盒（上海杰美基因公司），碱性磷酸酶染色试剂盒(武汉博士德公司) 。* @0 T) n5 S' B( V/ A

细胞培养

水合氯醛腹腔注射麻醉Wistar大鼠一只，无菌条件下取出腹部肠系膜脂肪组织和附睾脂肪垫。PBS（含200 U/mL青霉素和200 μg/mL链霉素）冲洗3次，眼科剪剪碎，加入0.2%胰蛋白酶37℃下振荡消化约8 min，吸出消化液，移入含胎牛血清的离心管中终止消化。在剩余脂肪组织中加入新的胰酶重复以上操作3次，将收集到的消化液以1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基重悬并接种于培养瓶中，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每3 d换1次培养液。8～10 d后，细胞达80%融合时0.2%胰酶消化传代，第三代细胞用于免疫组织化学鉴定及诱导分化，并以200个/mL的密度在培养皿中培养。# p- I4 t4 M( V5 V& t2 p7 \
& N5 M# K+ p- o3 T: F& a9 O
细胞诱导分化
0 c3 ?1 a8 P) `1 ^+ R: i3 N
大鼠脂肪组织源间充质干细胞的培养及诱导分化用0.2%胰酶消化第三代细胞接种于24孔板，置培养箱中培养，待细胞达到80%融合时，换成骨细胞诱导培养液（DMEM完全培养液中含10 mmol/Lβ  甘油磷酸钠、0.1 μmol/L地塞咪松、50 μg/mL维生素C）诱导ADMSCs向成骨细胞分化；同时，另一部分细胞以含10 μmol/L的5  氮胞苷的完全培养基处理24 h，PBS冲洗细胞2次后换上普通培养液培养。培养14 d、21 d后对细胞行免疫组织化学和组织化学鉴定。以未加诱导剂的普通培养液为对照组进行平行对照实验。
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免疫组织化学鉴定和组织化学鉴定$ V: `, \% y0 p2 Q. f( Q# E
* [# H) R6 O' V/ p; b
将细胞爬片以PBS洗清洗后95％酒精室温固定10 min；PBS洗5 min3，滴加含3％H2O2的甲醇室温孵育10 min；蒸馏水冲洗，PBS洗5 min3，以含2％BSA的PBS液封闭，37 ℃孵育20 min；甩去封闭液，分别滴加各种一抗工作液（兔抗NKx2.5、Ⅰ型胶原、骨钙蛋白多抗，兔抗CD13、CD29、CD44、CD45、连接蛋白Cx43多抗、小鼠抗结蛋白和肌节型肌动蛋白单抗）4℃过夜；PBS冲洗，5 min3，滴加生物素标记二抗工作液，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗，5 min3，滴加辣根酶标记亲和素工作液，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗，5 min3，滴加新鲜配制的DAB显色液显色5～10 min；蒸馏水冲洗经酒精逐级脱水，二甲苯透明后封片，显微镜下观察并拍照。另外，将一部分细胞爬片以茜素红染色试剂盒、碱性磷酸酶染色试剂盒进行钙质沉积和碱性磷酸酶组织化学染色，按照试剂盒说明书进行。

结  果

ADMSCs的形态观察+ f1 Q9 J; N0 ]& d/ A

细胞接接种24 h后内细胞很多已贴壁，并开始伸展多呈梭形，有的呈圆形或多角形，有粗大突起伸出，核居中有1～2个核仁，48 h后贴壁细胞开始分裂增殖多呈梭形外观，如图1(a)。细胞经传代后约3 d长满瓶壁，细胞排列呈漩涡状，如图1(b)。另外，第三代细胞低密度培养12 d，可形成细胞克隆，如图1(c)。" r6 D+ D) Z. @, M4 G' ^- `. Z

ADMSCs的免疫组织化学鉴定2 J0 A1 E( M( u

约90%所培养细胞胞浆CD13，CD44，CD29抗原呈阳性(图2)；有一些未经诱导的细胞表达结蛋白(图3)。3 E# x  m2 n+ D1 r9 F# M

ADMSCs向成骨细胞分化的鉴定
, w2 Q; Y. n  {. Y' t6 A
ADMSCs用成骨细胞诱导培养液,诱导分化2 d 就可见到细胞形态的改变,细胞由原来的- X+ X9 I0 F" P- S/ L

图1  ADMSC形态(100)

Fig.1  ADMSC forms (100)

(a): cells cultured for 2 d;(b): cells of passage 3;(c): clone of ADMSCs& p* K9 L7 j- f* z; g

图2  ADMSCs表面抗原免疫组化染色(100)
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Fig.2  Immunohistochemical staining of ADMSCs surface antigens (100)& y6 A9 K3 F. O" o3 S7 Z- i& Y
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(a):CD44;(b):CD13;(c):CD295 i7 k$ V1 T: B) v/ O/ i
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图3  ADMSCs结蛋白免疫组化染色(100)4 x. u6 v0 W. h4 D
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Fig.3  Immunohistochemical staining of ADMSC desmin (100)

梭形状变为扁平形；ADMSCs经诱导培养液培养14 d，碱性磷酸酶染色呈强阳性反应(图4a)；诱导分化21 d,细胞浆中骨钙蛋白也呈阳性表达(图4b), 在培养板上可见少量到胞外钙质沉积(图4c)。对照组均为阴性。
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ADMSCs向心肌细胞方向的分化3 o- Q# Z+ u$ G
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ADMSCs 用5  氮胞苷处理后，部分细胞由长梭形变为圆形或椭圆形，并发生聚集。细胞诱导分化14 d后，细胞浆和胞核中NKx2.5阳性表达(图5a)，肌节型肌动蛋白也呈阳性表达(如图5b)；细胞诱导分化21 d后，连接蛋白Cx43在胞浆中均呈阳性表达(图5c)，在显微镜下可见有些细胞有微弱搏动。对照组除肌节型肌动蛋白弱阳性外，其余均为阴性（图5d、e、f）。
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讨  论

MSC是广泛用于组织工程、细胞治疗和细胞分化研究的细胞，目前MSCs主要来源于骨髓。近年来，脂肪组织来源的间充质干细胞开始得到越来越多的应用。ADMSCs和骨髓来源的MSCs在形态和表型方面很相似［7］，在多向分化潜能和细胞表面分子标记方面也十分相似［8  9］。可见ADMSCs完全可能替代骨髓来源的MSCs，而ADMSCs还具有取材方便、来源丰富、病人易接受和可自体移植等优点。另外，Planat等［10］以含1%甲基纤维素的半固体IMDM诱导培养基将成年小鼠脂肪间充质细胞诱导为搏动的并有肌管结构的细胞。Gaustad 等［11］通过实验证明ADMSCs中有部分细胞已经开始向心肌细胞分化，表达Nkx2.5, 心肌钙蛋白Ⅰ等心肌标志，可见ADMSCs在心肌组织工程和心梗细胞治疗方面很有优势。# q, {" r* ]+ E

本实验采用胰蛋白酶分步消化法分离ADMSCs，每消化8 min，就收集消化的细胞悬液并以牛血清灭活胰蛋白酶，这样可减少胰蛋白酶的破坏作用，发挥了胰蛋白酶的分离功能。本实验未采用胶原酶消化，也未用红细胞裂解液处理，这样可以减少对细胞的损伤，减少实验步骤并减少实验费用。这种分离方法分离的细胞较从骨髓中分离的细胞多，也更省时省力；分离细胞长势很好，约8～10 d就长满可传代了，也比骨髓分离的细胞长得快。大多数细胞表达CD13、CD29、CD44，不表达CD45，这和骨髓来源的MSCs的表面标志是一致的；第三代细胞低密度培养12 d，可形成细胞克隆，这说明实验所培养的细胞有克隆形成能力。这些结果表明本实验采用胰蛋白酶消化法成功分离出了ADMSCs。另外，还发现有一些未经诱导的细胞也表达结蛋白和肌节型肌动蛋白，表明有一些细胞可能已经开始向肌细胞分化。2 v6 w) ~7 O4 w1 \

本实验用成骨诱导液诱导ADMSCs，通过组织化学和免疫组化检测，14 d后发现，细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性反应；21 d后,可见少量的胞外钙质沉积，细胞浆中骨钙蛋白也呈阳性表达。我们实验室以前用相同的诱导液也诱导骨髓MSCs成为成骨细胞［12］。这表明：象骨髓MSCs一样，ADMSCs可诱导分化为成骨细胞。本实验参照Sunil和黄艳等［13  14］的实验方法采用浓度10 μmol/L的5  氮胞苷诱导，细胞诱导14 d后，细胞浆和胞核中NKx2.5阳性表达，肌节型肌动蛋白也阳性表达；21 d后，连接蛋白Cx43在胞浆中呈阳性表达，诱导过程中，有的细胞形态发生改变，细胞由长梭形变为圆形或椭圆形，并发生聚集，诱导分化21 d后，可见有少量细胞有微弱搏动。NKx2.5是促进心肌形成和发育的重要基因，具有显著的心脏特异性表达，其表达对胚胎时期心肌前体组织定向分化起调控和维持的作用［15  16］, ADMSC经诱导可表达NKx2.5的结果表明：在体外诱导间充质干细胞向心肌细胞分化的途径应该与胚胎发育中心肌形成的途径相一致，肌节型肌动蛋白和连接蛋白Cx43均为心肌特异蛋白，在维持心肌功能方面必不可少。这表明本实验用5  氮胞苷诱导ADMSCs向心肌细胞分化是比较成功的。这些细胞可向成骨细胞和心肌样细胞分化的结果，进一步证明实验所分离培养的细胞为ADMSCs，具有多向分化潜能。0 t% K$ ~4 g% _* Z

结  论

通过实验，一方面成功分离培养出脂肪组织来源的间充质干细胞，另一方面还将ADMSCs诱导为成骨细胞和心肌样细胞，表明该细胞具有多向分化潜能，可能为骨组织工程和心肌组织工程以及心梗的细胞治疗研究提供新的干细胞来源，但实验所诱导出的心肌样细胞只有少量在体外微弱搏动，还需结合其他诱导方式进一步研究。
      【参考文献】
［1］  CHEN Lingzhong, WANG Yifei, ZHONG Cuiping. Histo  embryology  human Developmental and Functional Histology［M］.Shanghai:Shanghai scientific and technological literature press,2003:75  86./ H7 r4 ^4 [5 F
( L6 v  ~  K6 I" m

; O) }9 t  _, J5 u
［2］  PEI Xuetao. Stem Cell Experiment Protocol ［M］. Beijing:Science press, 2006:83  100.- F& c  ?9 q( u, A4 d0 b' Z- F. h

; G; e+ T- n; Z+ I% @( {# d
［3］  deGirolamo L, Sartori MF, Albisetti W.Osteogenic differentiation of human adipose  derived stem cells: comparison of two different inductive media ［J］. J Tissue Eng Regen Med,2007，1 (2):154  7.

［4］  ZHANG Shengli, DENG Zhansheng, LI Baojun, et al. Osteogenic differentiation of rat adipose  derived mesenchymal stem cells［J］. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research,2007, 11(6):1022  1024.

7 f6 {5 I+ R! g" i' P* k8 D5 t
［5］  Rangappa S，Chen F，Lee EH，et al．Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes ［J］．Ann Thorac Surg，2003，75(3)：775  779.1 p4 b) r$ M( c( \: B4 a6 u. q+ B

［6］  LI Bingong, ZENG Qiutang, WANG Hongxiang, et al.  Study of cardiomyogenic cells differentiation from adipose tissue stromal cells under the induction of myocardial cell lysate［J］. Chin J Crit Care Me,2006,26(4):280  282.# w$ g' ~. c' b+ s0 d

［7］  Lee RH, Kim B, Choi I, et al.Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adiposetissue［J］.Cell Physiol Biochem,2004,14(4):311  324.) s7 W, w+ H% w- Q

. }3 c+ o; r. p' g8 z

［8］  Strem BM,Hicok KC,ZHU.Multipotential differentiation of adipose tissue  derived stem cells［J］.Keio J Med,2005,54(3):132  141.

, Z; x& [8 R6 H* T2 Q/ j
- c& ~  v6 V3 ^; v. r# z
［9］  Cheryl TG,Karen JL. Stem cells and adipose tissue engineering［J］. Biomaterials,2006,27(9):6052  6063.( `. F6 z4 T% q. C9 L- I

［10］  Planat  Benard V,Menard C,Andre M,et al.Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells［J］. Circ Res,2004,94（2）:223  229.
; f: r* M' r. a
. W) E/ [% x$ s/ D$ B6 O- }  @
4 U9 S4 a3 }: X0 o0 s
［11］  Gaustad KG, Boquest AC, Anderson BE,et al. Differentiation of human adipose tissue stem cells using extracts of rat cardiomyocytes［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications,2004, 314（2）: 420  427.
1 d/ M, j: |/ q1 X; Q7 S

5 S0 i: x0 ^* L$ l  n8 Z6 R
［12］  ZHAO Hongbin，ZHANG Xizheng,WU  Jimin, et al. Construction of tissue engineered bone based on rat bone marrow mesenchymal stem cells and eggshell membrane［J］. Int J Biomed Eng，2007,30(1):1  4.6 r; W) ~4 h7 y$ \  o2 C
) k9 N' g5 ~' V

3 ?5 T" L/ H6 A, H: `9 F8 ?
［13］ Sunil R,Chen F,Lee EH, et al.Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue in to cardiomyocytes［J］.Ann Thorac Surg,2003,75(10):775  779.
. O# x* W1 }# C
; a2 r) m; O) @% ~
: E6 f% U" `. u9 |' r) J; L( @; R
［14］  HUANG  Yan,LI Yinghui,YANG Fen,et al. Induced cardiomyogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells  in vitro［J］. Space Medicine & Medical Engineering,2006, 19(6):408  411.
0 ~  P( o, g; p9 y
0 d5 X9 j) r; D; h& e. D
3 I; D6 i$ t) p9 L2 V( |' s
［15］  Lien CL,McAnally J, Richardson JA, et al. Cardiac  specific activity of an Nkx2.5 enhancer requires an evolutionarily conserved Smad binding site［J］. Dev Biol, 2002,244(2):257  266.
( b( _# g1 E2 F& U
) V* N* C( S# u

［16］  WU Xiushan.Signaling Pathways and Heart Development［M］.Beijing: Chemical industry press,2006：97  104.

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