复旦大学璩良等通过化学合成RNA寡核苷酸绕过IVT，个性化疫苗生产从数月缩短至数天

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PNAS：复旦大学璩良等通过化学合成RNA寡核苷酸绕过IVT，个性化疫苗生产从数月缩短至数天) ~% l6 v+ e! G1 f2 ^
1.        体外转录（IVT）
5 {/ a6 _2 K5 O3 s/ n9 y2.        RNA寡核苷酸/ d# {1 O3 d2 \0 B9 ~' M
3.        RNA疫苗4 @; [6 {7 F: b4 R3 `! c
来源：iNature 2026-07-29 12:41
" r# ]8 g2 l( }1 X+ E' x- W本研究建立了一种无需IVT的RNA疫苗平台，能够实现个性化癌症疫苗的快速、安全且高度可成药的生产，具备显著的临床应用潜力。
. x) S. [& f( h6 O个性化信使核糖核酸新抗原疫苗在癌症治疗中展现出巨大潜力，但其定制过程通常需要三个多月，这可能导致患者失去最佳治疗窗口。造成这一延迟的主要原因在于，当前mRNA疫苗的生产依赖于质粒发酵和体外转录（IVT），涉及多个复杂步骤。
- Q" M1 Z& @( [1 d% j2 S化学合成的RNA寡核苷酸，例如反义寡核苷酸（ASOs），在合成过程中无需DNA模板或IVT，因此能够实现快速生产。然而，ASOs的长度有限，无法编码蛋白质。/ N; g5 F+ X8 Q- L- J" m8 Q
2026年7月16日，复旦大学璩良，杨辉和Qian Pan共同通讯在PNAS在线发表题为“IVT-free, chemically synthesized protein-encoding RNA oligonucleotides for rapid production of personalized cancer vaccines”的研究论文。" ^0 D% @8 i6 b1 c% e% ?2 Q! ?
该研究引入了一种长度为39个核苷酸的帽非依赖性翻译增强子（CITE）元件，命名为BBV，该元件能够驱动RNA翻译。此外，BBV与高效的滚环翻译（RCT）过程兼容。
; b; K4 ?  V( j5 h( T# n9 R$ K& l7 F作者通过化学合成了含有BBV及目标基因（GOI）的RNA寡核苷酸，其具有特征性的5'-OH和3'-P末端，可通过内源性RtcB RNA连接酶进行环化，并在哺乳动物细胞中通过RCT高效编码蛋白质。作者将这些RNA寡核苷酸命名为蛋白编码RNA寡核苷酸（PEOs）。; J+ c# N9 o9 S7 Y% _
值得注意的是，与IVT生产的RNA相比，PEOs中促炎性双链RNA的含量无法检测，表现出极低的免疫原性。作者进一步证实，PEO-OVA（编码OVA抗原）在抑制肿瘤生长方面的效果与mRNA疫苗相当。在一种原位胶质瘤模型中，PEO疫苗与免疫检查点阻断疗法联合应用也显示出治疗效果。; l0 T" t/ ?! ~/ F' Y+ W
本研究建立了一种无需IVT的RNA疫苗平台，能够实现个性化癌症疫苗的快速、安全且高度可成药的生产，具备显著的临床应用潜力。
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基于mRNA的个性化癌症疫苗已显示出针对恶性肿瘤的巨大治疗潜力。然而，个性化mRNA疫苗的工业化生产需要长达三个月的时间，这常常导致错过癌症患者的关键治疗窗口，并影响患者的生存率。
& A* M0 ^# A9 e- i/ m  X. }& n这种延迟的产生是因为当前的mRNA疫苗生产依赖于DNA模板和体外转录（IVT），涉及多个耗时的步骤，如基因合成、质粒构建和细菌发酵、IVT以及下游纯化。作为一种临床级别的产品，每个步骤都需要严格的质量控制。( e( J! j! K# M; d- x, ]. c
此外，由T7 RNA聚合酶介导的IVT会产生双链RNA（dsRNA）杂质，这些杂质会诱导强烈的先天免疫应答，通过激活RNase L导致RNA降解、翻译抑制，并引发更高的安全性担忧。8 W" z7 Z: X4 X# T5 `
尽管通过高效液相色谱（HPLC）进行RNA纯化、使用T7聚合酶突变体进行IVT或进行核苷修饰可以在一定程度上降低IVT所产生RNA的免疫原性，但这些方法并不能完全消除IVT副产物在体内诱导的先天免疫刺激。因此，迫切需要开发一种不依赖IVT的RNA疫苗平台，该平台无需DNA模板和生物发酵，从而能够快速生产个性化新抗原疫苗。( f8 L5 R: y/ Y& r" s7 K6 N

! R8 @7 s4 S# K5 o& w图1.短CITE元件激活了RNA的翻译起始（摘自PNAS ）  P2 x' l3 ?; Q" g/ ~5 K' q( Y7 }
RNA寡核苷酸，如反义寡核苷酸（ASOs）或siRNA，是通过完全化学固相合成的，无需DNA模板或IVT，因此能够实现快速生产，并在安全性和成药性方面具有潜在优势。此类寡核苷酸可以通过计算机模拟设计并直接合成，这将大幅缩短疫苗生产的时间线，并避免产生酶促生成的杂质，如dsRNA。/ i/ z& W2 \+ I* X% u$ S6 Q
然而，化学合成RNA寡核苷酸的长度有限（通常少于150个核苷酸），限制了其编码蛋白质的能力，因为线性mRNA的必需翻译元件包括5‘端帽结构、目标基因（GOI）和3’端poly(A)尾，而环状RNA（circRNAs）除了GOI序列外，通常还需要长约500至700个核苷酸（nt）的内部核糖体进入位点（IRES）元件。- I6 x) I) g/ K' A! c2 M( _
Poly(A)尾和长IRES导致总长度超过了完全化学合成所能达到的最大长度。因此，化学合成的RNA治疗药物主要是ASO，它们通过转录或转录后非编码机制发挥作用，无法编码蛋白质。/ l5 D0 O4 M/ Q5 z  ]
最近，一些研究团队尝试通过化学固相合成RNA寡核苷酸来编码蛋白质。例如，Hiroshi Abe等人化学合成了带有帽结构的RNA寡核苷酸；然而，增加的合成复杂性和较低的翻译效率可能会阻碍其进一步应用。线性mRNA的翻译需要5’端帽结构和3‘端poly(A)尾通过真核翻译起始因子4γ（eIF4G）-PABP交互作用在物理上靠近（通过非共价5’端到3‘端的环化作用）以启动翻译。
/ G5 g7 l* Q2 B  _为克服这一限制，有两个研究团队分别采用酶促（T4 RNA连接酶）或化学催化连接的方法，在体外将化学合成的线性RNA进行共价环化，从而在一定程度上提高了翻译效率。然而，额外的酶促或化学环化步骤及其后的纯化增加了生产时间，并且由于稳定性和质量控制方面的挑战，使得工业化放大过程复杂化。
2 r4 M2 W* Y6 ~0 \此外，化学环化策略在某些情况下可能会引入非天然的P-N化学键，这可能潜在地影响化学合成RNA寡核苷酸的正常蛋白质翻。尽管已引入帽类似物以避免circRNA中使用长IRES序列，但这些方法仍然依赖于IVT，并且需要在合成的加帽寡核苷酸与IVT产生的RNA之间进行酶促或化学连接，进一步增加了复杂性和生产时间。: _( c/ [# ]3 h5 o* y2 _+ U  o
一项近期研究表明，在RNA侧翼连接Twister核酶序列后，通过自剪接可产生5‘-OH和2’,3‘-环磷酸末端，当这些RNA被递送至哺乳动物细胞时，可被内源性RtcB RNA连接酶共价环化，生成circRNA。此外，circRNA能够形成共价磷酸二酯键，支持高效的滚环翻译（RCT），该机制在circRNA上采用单次起始、连续延伸的方式，能够产生比经典线性翻译显著更高的蛋白质产量。
! ^9 R: e$ A  k! u: j) q# I因此，开发一种快速、一步法化学合成、具有高效蛋白质编码能力且无需额外处理的RNA寡核苷酸极具吸引力，这将能够在保留化学合成寡核苷酸优势的同时，实现个性化肿瘤新抗原RNA疫苗的快速生产。
  j/ t* Q1 q* G参考消息：https://doi.org/10.1073/pnas.2529799123
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