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作者：刘先宁,朱秀萍,银 勇,吴 洁 ,杨 华,张长宁作者单位：1中国陕西省西安市,陕西省眼科研究所；2中国陕西省西安市眼科医院 " Z" n0 y/ J( z( \9 F
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$ Z8 H3 A. `3 x2 [+ s% k 【摘要】 目的:观察以干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织的生物学特性。 方法:采用组织块培养法获得新西兰大白兔角膜缘干细胞，经胰蛋白酶消化法获得细胞，种植于干燥脱水法保存的鸵鸟角膜板层基质上，采用气液界面培养法进行培养，通过倒置显微镜、透射电子显微镜、荧光显微镜观察其形态学、生长特点，超微结构及免疫学特征。 结果:在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质上种植兔角膜缘干细胞，接种72h后，细胞形成单层，移置气液交界面后继续培养7～10d，逐渐形成复层。经光镜、透射电镜、及免疫学检测显示其具有角膜上皮组织的生物学特性。结论:兔角膜缘干细胞能够在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质载体上生长，并可形成复层，基本具有正常角膜上皮细胞的形态、超微结构和生物学特性。 & P( Q4 a" L9 z8 B0 y) `; x
【关键词】兔角膜缘;干燥脱水法保存鸵鸟角膜基质;干细胞;细胞培养;人工生物角膜上皮组织
# _+ y! Y6 h) j( ^: w4 A: {+ t Constructing artificial biologic cornea epithelial tissue on the carrier of heterogenic corneal stroma stored with desiccation and dehydration method5 Y( K; |0 V2 {0 k
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XianNing Liu1, XiuPing Zhu1, Yong Yin1, Jie Wu2, Hua Yang1, ChangNing Zhang2 U9 G/ t8 b. Q- S: ]
* B* R m/ o0 {) W/ \Foundation item:Key Project Foundation of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (No.2003K10G29): [. {. ~# A6 L& B
+ d) X/ T$ k' H, I& @1Shaanxi Provincial Ophthalmic Institution, Xian 710002, Shaanxi Province, China; 2 Xian Eye Hospital, Xian 710002, Shaanxi Province, China
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AbstractAIM: To observe the biologic features of the artificial biologic cornea epithelial tissue constructed on the carrier of heterogenic corneal stroma stored with desiccation and dehydration method.- L0 y# b" j: ~9 B% g1 L1 x
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METHODS: Limbal stem cells of New Zealand white rabbits were obtained with tissue block culture method. The cells gotten from trypsin digestion method were implanted on heterogenic corneal stroma stored with desiccation and dehydration, and cultured by airliquid culture method. The morphology, growth, ultrastructure and immunology characteristics were observed under inverted microscope, transmission electron microscopy and fluorescence microscope.
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RESULTS: After 72 hours, limbal stem cells implanted on heterogenic corneal stroma formed single layer. Seven to ten days after transplanted to airliquid interface, the cells formed multi layer, which had biological characteristics of corneal epithelium tissue under inverted microscope, transmission electron microscopy and fluorescence microscope.7 y( d6 |8 O8 w# v# `/ X
3 s1 B# X) I" c* @1 T# H4 _CONCLUSION: Limbal stem cells of rabbits can grow on the carrier of heterogenic corneal stroma stored with desiccation and dehydration method, and can form multi layer. The cells have the shape, ultrastructure and biological characteristics of corneal epithelium tissue.. f9 q' B7 B" c* x( h4 F# r# C
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KEYWORDS: rabbit corneal limbal; heterogenic corneal stroma stored with desiccation and dehydration method; stem cells; cell culture; artificial biologic cornea epithelial tissue
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Liu XN, Zhu XP, Yin Y, et al. Constructing artificial biologic cornea epithelial tissue on the carrier of heterogenic corneal stroma stored with desiccation and dehydration method. Int J Ophthalmol- U- k) l+ Z0 J" x
4 L4 X# _/ w5 d0 X/ D m4 z; V(Guoji Yanke Zazhi)2008;8(11):221422163 ~1 P9 v; R: b0 ]
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0引言1 ]9 |" y* L* A" ^ x: L
3 Q; Y7 O5 }* s% g* g+ y据统计，每年由角膜病及外伤而致盲的病历居全球致盲性眼病的首位[1]。同种异体角膜移植是治疗角膜盲的根本手段。苦于供体材料来源困难，严重制约了该手术的开展和普及。离体角膜缘干细胞的培养成功，无疑为那些角膜缘功能衰竭患者带来希望[2]。如何构建人工生物角膜，是眼科界最新、最有前景的研究热点。我所利用干燥脱水保存的鸵鸟角膜基质为载体材料，并在其上培养成功富含角膜缘干细胞的上皮基质膜片，为进一步角膜移植体外培养的干细胞创造条件。9 h) A# U4 L! V
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1材料和方法% c) h; r; u7 Y; u* @/ j) y/ i# J
0 p- P8 p+ h0 S: z0 |3 a8 }1.1材料兔眼角膜缘组织来源：4～6mo龄健康新西兰大白兔（西安交大医学院实验动物中心提供符合国家实验动物使用标准，质量2.0～2.5kg，雌雄不限）,鸵鸟眼球:西安英考王驼鸟公司提供。DMEM/F12 1∶1培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（美国GIBCO公司）；青霉素和链霉素（山东鲁抗医药股份有限公司）抗角蛋白K3单克隆抗体AE5（CHEMICON EUROPE公司）;抗PCNA单克隆抗体（博士德生物工程有限公司）；纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）（陕西众美生物科技有限公司进口分装）。' \ l2 X, @7 h
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1.2方法
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4 }, J9 ~8 \0 N8 a1.2.1鸵鸟角膜基质载体准备与保存[2]以无菌操作取出鸵鸟眼球，用1/10000升汞溶液，生理盐水，2000U/mL庆大霉素液交替冲洗，刮除角膜上皮，剖切获取驼鸟角膜基质层，厚约200μm，采用含 2.5g/L胰蛋白酶、0.2g/L EDTA的HanKS液37℃消化60min去除残余的上皮及基质游离细胞。将处理好的角膜基质片放在一无菌平皿中，置于干燥器内，干燥器盖边缘涂凡士林悬紧密封，置于4℃冰箱，干燥脱水48h后取出，在无菌条件下置于准备好的保存瓶内，加盖密封，贴上标签注明供体取材时间等。使用前先检查保存瓶内兰色硅胶有无变色（如变红色说明水分进入，弃之不用），复水后再检查保存角膜基质片有无裂纹破裂浑浊。达到保存质量标准的方可使用。接种细胞前复水，紫外线照射灭菌双面各30min，置4孔板备用。
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1.2.2载体基底膜化处理用0.1g/L FN浸泡载体，置37℃培养箱孵育1h，取出，再放入0.1g/L LN液体中浸泡,置37℃培养箱孵育1h，吸出液体培养箱内干燥1h备用。* l5 s! X% C5 S5 N; Y
, \& K/ Z# \& f! z2 t4 m1.2.3细胞接种无菌条件下取兔眼球，用含青霉素、链霉素（200U/mL）的生理盐水反复冲洗眼球，剪下角膜缘，切除残存的结膜和色素组织，去除角膜内皮及大部分基质，将其切成1mm2mm组织块，置培养瓶中，上皮细胞面向上，加入细胞培养液（DMEM与F12Hum培养基1∶1混合物，含200mL/L胎牛血清，100U/mL青、链霉素，4mmol/L谷氨酰胺、1000U/L胰岛素，5μg/L表皮生长因子，0.18mmol/L腺嘌呤等），置37℃，50mL/L的CO2恒温培养箱培养。根据代谢情况，3～4d换液一次，当细胞密度达到80%～90%时进行消化传代，按2105个细胞/mm2面积接种于铺有驼鸟角膜基质的4孔培养皿中，培养条件同前；于倒置显微镜下观察细胞的生长情况并摄影记录。当细胞生长72h，取细胞膜片移置入Transwell培养板进行培养，载体的底面为培养液，上皮面暴露于气体中，形成气液交界面，继续培养7～10d形成复层。: r2 r" S9 |' A# @# \9 G
9 }) w, X0 i1 m9 ~4 c5 B' W2结果
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倒置显微镜下所见:兔角膜缘干细胞接种于鸵鸟角膜基质上，72h，形成单层细胞膜片，细胞呈卵圆形、胞质丰富，核质比为1∶2(图1)。光镜下所见：培养1～7d，组织切片HE染色，见上皮细胞4～5层，细胞呈极性排列，就基底部为柱状细胞，其上为翼状细胞，最上为扁平状细胞，形态近似正常上皮的复层结构。基质层为胶原纤维(图2)。透射电镜所见：培养7～10d可见多层细胞，含丰富的细胞器，可见基底细胞特有的张力丝、基底膜及细胞间桥粒连接(图3，4)。免疫荧光染色所示：培养7～10d，胰酶消化膜片上皮细胞层采用抗PCNA的单克隆抗体及抗K3的单克隆抗体及进行间接免疫荧光染色,结果具有阳性表达证实其角膜缘干细胞来源及有分化的角膜上皮细胞表型(图5，6)。
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4 E+ s6 B- J; p( M6 r( v0 s图1倒置显微镜下兔角膜缘干细胞接种于鸵鸟角膜基质上72h生长形态为圆形、卵圆形、胞核大、细胞透亮（200）
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/ I2 s, W" v9 H图2光镜下兔角膜缘干细胞在干燥脱水保存的鸵鸟角膜基质上生长的组织结构图（200）上皮细胞4～5层，细胞呈极性排列，较生理状态下紊乱；基底部为柱状细胞，其上为翼状细胞，最上为扁平状细胞，形态接近正常上皮的复层结构；基质层为胶原纤维，排列较紊乱4 u7 w6 v% L/ e; M
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3讨论
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重建人工生物角膜最大的难题是载体材料。不适合的支架材料无法满足培养角膜细胞的生长，有的人工合成材料不能全部满足透明性好，抗拉力强大等要求，甚至在植入后发生角膜基质溶解和钙沉积等问题。异种角膜基质由于其具有和角膜最接近的光学性能、韧性、天然结构相似，以及来源广泛等优点，成为近年来的研究热点之一。王智崇等[3] 通过动物实验从细胞免疫和体液免疫两个方面，对角膜三 层含细胞组织的免疫原性进行相对量化分析，得出了三者间免疫原性的比率，验证了角膜内皮免疫原性最强，基质免疫原性最弱的结论，表明角膜基质有进行异种移植的免疫学基础，为临床应用异种角膜基质提供了理论依据。
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近年来，先后有学者研究采用人羊、膜、猪等异种脱细胞基质为载体构建部分人工生物角膜组织[4，5],我们也对上述载体进行了实验研究，认为羊膜作为载体，虽具有良好的组织相容性、抗炎和抗新生血管的作用，但韧性差，干细胞在其上生长不均匀，易脱落。猪角膜脱细胞基质作为载体虽具有天然角膜的板层纤维结构、韧性及厚度，但由于大部分猪在屠宰时，先在沸水中烫毛，这样往往伤到角膜，使角膜基质处理后难以保持透明，限制了它的应用。
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本研究采用鸵鸟角膜基质作为载体材料，原因：（1）鸵鸟角膜韧性较强，抗拉力强大，不易发生溶解，干燥脱水法保存角膜基质复水后透明性好；（2）我们通过测定发现鸵鸟的角膜曲率半径内皮细胞计数和人角膜极相似；（3）有研究显示鸵鸟—兔板层角膜移植在早期能完全保持透明，未观察到超急性排斥反应的发生，无感染、层间积血、层间积液、崩线情况出现，无1例发生溶解[6]。说明鸵鸟角膜植片作为异种植片移植时有较好的生物相容性；（4）由于供体来源所限，有术者报告用新鲜异种（鸭、鱼）角膜移植治疗角膜穿孔，并取得较好的治疗效果[7，8]；还有西安市眼科医院朱秀萍等[9]自1976年开始,用干燥脱水法长期保存的角膜及角巩膜植片成功的为1287例患者进行角膜移植术后,术后植片透明率平均为94.9%，亦奠定了以干燥脱水法保存鸵鸟角膜基质作为组织工程支架材料的基础。我们在培养成功角膜缘干细胞的基础上，首次以干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质为载体成功的构建了兔角膜上皮组织，经形态学及免疫学检测，其具有角膜上皮细胞特异性K3的表达[10]，显示上皮细胞的表型与正常角膜相符。同时免疫学检测表明具有角膜缘干细胞增殖力标志物PCNA的表达，证实构建组织中角膜缘干细胞的存在,这与Ralph的研究结果相符。 Ralph等对14例角膜组织进行PCNA的免疫组化染色，发现未经培养的组织中只有角膜缘干细胞内含PCNA[11]。
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5 M9 K' X: D3 K4 R6 Y% E目前，随着人工大规模养殖鸵鸟的不断普及，加之我们拥有西安市眼库，获取角膜、干燥法保存角膜基质技术已经成熟，尽管构建的上皮组织，还存在着诸多待研究的问题，如细胞排列紊乱、上皮细胞层数少，无神经支配等。但我们相信随着体外培养环境的不断优化，动物实验的不断深入，这些问题会逐渐解决的。生长有干细胞及由干细胞分裂增殖的各层上皮细胞基质膜片的培养成功，为体外培养角膜缘干细胞的临床应用奠定了基础，为人工生物角膜的研究开辟了一条新途径。
' z5 N' x9 | y 【参考文献】; X/ P4 |9 s. c
1李沁华.角膜组织工程的研究进展.中国修复重建外科杂志2004;18(3):2303 |6 q) X6 Y; z; l- Q
5 g/ o* q& Z# v, b3 Z( C
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$ e' l4 s& J- S# c- S 2朱秀萍, 银勇, 刘先宁,等.干燥脱水法长期保存角膜及角巩膜植片的组织活性研究.眼科研究2002;20(2):136* y+ w( r; E) C, ^) c! m% v
. s) G. E r9 f! I
6 K: L. S1 O6 B9 Z' D W, O& N/ R$ x6 W- \+ D. ^6 t
3王智崇,葛坚,徐锦堂,等.角膜不同组织免疫原性分析.中华眼科杂志2002;38(9):535538
- |- i' @2 e: [' G+ G
( ^* \" \- u Q; [& z" n* ?4 ~/ w: N s( F( g
% U1 x: L( {" a$ ?" V 4刘蕾，洪晶.以不同性质羊膜为载体培养人角膜缘干细胞的生物学特性.国际眼科杂志2006;6(5)：10301034% ?1 h0 n$ l, R8 I
; q; Q" S7 N. D, D
5 s& W4 Q: z9 b/ _2 j% g4 ~5 L
- L- S" u9 ~) \. b- d- w 5范先群， 陈苹 ，傅瑶.以异种角膜脱细胞基质为载体构建角膜上皮载体内皮复合物的实验研究.中华眼科杂志2007;43（5）:437 441; N6 s8 ^6 ]) W4 K1 V( i
! A6 w: [! ]3 }8 X- [6 F! E4 Y6 a i
2 q; {' u L8 h8 Q
2 C! ]2 e% Q6 g( v( ?; r" ] 6潘东艳，柳林，刘银萍.鸵鸟角膜对兔板层角膜移植的排斥反应.国际眼科杂志2005;5(4):651
9 F& N6 S+ D4 M) L# j. i
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8 w7 U# ~1 Q) b# g4 X) u+ @- h' W8 `! M$ T
7韩真真.用甘油保存同种角膜及新鲜异种角膜移植治疗角膜穿孔.中西医结合眼科1994;2:9192
) j7 S, [0 |3 `" V
; S7 k7 O. \2 Y# Y2 H; _7 U2 V0 c, D: H" g- t+ C
7 A/ G9 O* @* G" z( e 8马生虎,陈建宏,金秉义,等.异种角膜移植术临床研究.眼科新进展2000;20(1):43 442 d! R) [% z A) p! l& k
3 \' z4 j5 u+ P/ w1 m
4 D( |" v1 ]7 D4 q/ z! V- s( [& O
( B- S* I. C# f1 p% U
9朱秀萍, 银勇, 刘先宁,等.干燥脱水法长期保存角膜及角巩膜植片的组织活性研究.眼科研究2002;20(2):1356 W- `& a" e% R4 w5 e
: n* V$ C- _- Y# X
2 _" N0 u4 H$ c- e0 F6 `% k+ c3 j+ e/ O3 x( l2 T% W7 u! i2 ^
10 Schermer A, Galvin S, Sun TT. Differentiationrelated expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal Location of corneal epithelial stem. Cell Biol1986;103(1):49 62
% J" O, Q; F$ a4 z4 k- f# f( d. J7 W2 h2 {+ D
d" Q* z$ f; F) q( B6 q- E T0 o
! B' p* I: W1 P* |5 W! a 11白靓,周余来,成岩,等.兔角膜缘干细胞的研究进展.现代生物医学进展2007;10(7):1579 |
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发表于 2009-3-3 11:51
发表于 2015-6-8 18:35
