八手研究员请教~浓度不同的胰E，EDTA，DEPC,

maozhuxiwo1

请教啊：
( I- C0 c: O0 a, V        浓度不同的胰E，EDTA，DEPC都有何不同啊?
1 u; `) R- ]' n. ?       分别用PBS,F12培养基配出的胶原酶对hES传代影响大吗？. a. `7 P! E. p$ n2 f$ i# a
                       谢谢谢谢啦

w1986725

浓度不同消化强度不同，所消化的时间也不同，一般用Gibco的0.05%trypsin-EDTA较好，只需37度消化5min，就差不多了！EDTA作为很好的螯合作用对胰酶的溶解有好处，溶解较为均一，对干细胞的消化较好！我推荐使用，0.25%的也用过，消化的很快，较难控制，建议你如果使用浓度较大的，注意细胞的消化状态。

w1986725

PBS、F12从组成上而言，没用什么大的区别，都是盐的缓冲液，不过是可能F12中含有HEPES增大缓冲能力，建议使用F12，因为它的成分是你培养液的成份之一，细胞很介意环境的较大变化，而且胶原酶消化需要几个小时，尽量保证它的环境影响是至关重要的，如果有条件可以测一下液体的渗透压。

maozhuxiwo1

回复 3# w1986725
1 D# D5 O% S7 A9 L1 d* `; ^3 j) j) a6 d* N
/ F5 x# c9 E' {- x8 ~1 u" C
恩 下午老师来了我问了一下专门养干细胞的老师。
5 d/ {* p% A! Y5 U* U" B她的是用F12配成的胶原酶消化，一般10分钟克隆就会卷边，用不了几个小时的。但是听别的师兄说 ，用PBS配成的胶原酶，死细胞特别的多 ，并且扩开的ES上面黑点很多，很影响状态。
+ P( V9 x2 k9 x( M今天总算把这个消化问题搞清楚啦！！！  谢谢你拉

w1986725

可能配制的浓度不太一样了，总之，你搞清楚问题就好，配置药品浓度是个很重要的问题，大家共同学习！

双刀

浓度不要太高。消化后显微镜镜检一下。

maozhuxiwo1

回复 5# w1986725 * N4 s0 N8 t1 d- h* A
, v- x1 N9 w5 ~* T. A

& H; L( \0 l$ [, J$ k6 k6 q9 F    恩，我今天还和同事讨论了下。我们用的胶原酶浓度是1mg/ml  （胶原酶是用F12配制的）    5 q8 v. B# z% y( Z
    使用时用F12稀释成4ml 或者6ml不等。即使不卷边，也会在半小时的时候吹散，或者边吹边刮（视你要的克隆的大小了）
7 t4 o* A% r( @1 N5 A   消化不会超过半小时的。
+ }0 ~; n& W5 E  A0 ]8 {) F   不知道你们用的胶原酶怎么配的  浓度为多少？每个实验室的做法都不一样，但是基本的概念都应该差不多吧。) U5 R* Y0 E  J
   现在对hES也没有个标准判定，我就觉得把他养的壮壮的就好啦哈哈哈

farmer

学习再学习

bunny19870512

我们买的SIGMA的大瓶,分装的...直接用,还是崇洋媚外下...

gaorongbest

回复 maozhuxiwo1 的帖子) w5 v4 D& P# h8 B' b# Y

6 p4 ~. m" r$ L用PBS配制胶原酶真的会出现很多黑点点吗?这是什么原因呢?我用DMEM配制的胶原酶也这样,不知道是什么原因呢.反正长出来的细胞很奇怪.