经冠脉自体骨髓干细胞移植改善左室重构机制的研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 11:51 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：李树仁  齐晓勇  张建清  胡福莉  孟寸良  刘会良  王天红  党懿  李英肖  郜利会  靳福昌  吴迪  董洁作者单位：(河北医科大学附属河北省人民医院，河北  石家庄  050051)
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      【摘要】  目的  研究自体骨髓单个核细胞（BMMNC）和间充质干细胞（MSCs）移植对急性心肌梗死（AMI）后心室重构的影响，探讨不同干细胞移植对心室重构影响的机理。方法  以小型猪为研究对象，通过球囊导管压迫冠状动脉前降支的方法，建立小型猪AMI动物模型。在AMI 90 min时，经冠状动脉腔内进行自体BMMNC和MSCs移植。于术前及干细胞移植后28 d，观察心功能、心肌微血管计数、心肌核因子κB、心肌细胞凋亡、心肌血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的mRNA表达。与心功能进行相关性分析。结果  (1)术后28 d，BMMNC组、MSCs组EDD均明显低于AMI模型组(P=0.005)，EF明显高于模型组(P=0.000 1；P=0.001 7)。(2) BMMNC移植组血管数比梗死组及MSCs组增加(梗死区P=0.000 1，边缘区P=0.000 1)。 (3) BMMNC组及MSCs组心肌细胞凋亡率比梗死模型组减少(梗死区P=0.000 1，梗死边缘区P=0.000 1，正常区P=0.005 2)。(4)BMMNC组及MSCs组NFκB阳性率比单纯AMI模型组显著降低(P=0.001)。(5)梗死模型组、BMMNC组以及MSCs组的梗死区及梗死边缘区的VEGF基因表达量与正常对照组的相比增加(梗死区P=0.000 1;梗死边缘区P=0.000 1)。BMMNC及MSCs移植组，心肌梗死区的bFGF基因表达量比梗死模型组及正常对照组均显著增加（P=0.000 1）。LVEF与心肌细胞凋亡呈负相关（r=-0.441 1，P=0.027 3）,与心肌NFκB负相关(r=-0.579 6，P=0.000 6);与梗死区、边缘区血管数正相关（r=0.775 0,P=0.000 3）；与VEGF表达正相关（r=0.565 1，P=0.018 1）；与bFGF表达正相关（r=0.573 5,P=0.016 1）。结论  经冠脉自体BMMNC及MSCs移植均可减轻心肌梗死后左心室重构,改善急性心肌梗死后心功能，增加心肌血管数量，增加梗死区及梗死边缘区VEGF及bFGF表达，减少心肌细胞凋亡。心功能的改善与干细胞移植后增加心肌血管数量、增加心肌VEGF及bFGF表达、减少心肌细胞凋亡以及减少心肌组织NFκB水平有关。 # i, o- u6 a' [$ P
      【关键词】骨髓单个核细胞；骨髓间充质干细胞；细胞移植；急性心肌梗死；心室重构
   　　The study of intracoronary transplant self bone marrow stem cells on the effects of ventricular remodeling after acute myocardial infarction
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　　LI ShuRen, QI XiaoYong, ZHANG JianQing, et al., M0 Q, @& d7 T0 A6 A
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　　Hebei Medical College Attached Hebei Provincial People′s Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei, China+ R/ n9 O% [$ X' K* W# @
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　　【Abstract】ObjectiveTo study the influence of transplanting autologous bone marrow mononuclear cells (BMMNCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in acute myocardial infarction (AMI) models on ventricular remodeling and to investigate its mechanism of transplanting different kinds of stem cells.MethodsAMI swine models were established by obstructing left anterior descending (LAD) artery with Foley′s tube. Self BMMNCs and MSCs were transplanted into LAD artery 90 minutes after AMI. The heart function, the number of blood capillary, nuclear factorκB (NFκB) expression, myocardial apoptosis, the expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) were observed before operation and 28 days after transplantation.Results①The swine′s enddiastolic diamater (EDD) were obviously smaller (P=0.005), and left ventricular ejection fraction (LVEF) and fractional shortening (FS) in shamoperated and BMMNCs and MSCs groups were higher（P=0.000 1；P=0.001 7）than those in AMI model group 28 days after transplantation. ②The numbers of blood vessels in infarction region and marginal zone were significantly increased in AMI, BMMNCs and MSCs groups than that in shamoperated group, that in BMMNCs group were higher than that in MSCs group (infarction zone P=0.000 1; marginal zone P=0.000 1). ③The cadiocyte apoptosis rate in BMMNCs and MSCs groups were lower than that in AMI model group (infarction zone P=0.000 1; marginal zone P=0.000 1; normal zone P=0.005 2), but there were no significant differences between BMMNCs and MSCs groups. ④ NFκB expression in BMMNCs and MSCs groups were lower than that in AMI model group (P=0.001). ⑤The VEGF gene expressions in infarction region and marginal zone of AMI model, BMMNCs and MSCs groups were higher than that in shamoperated group (infarction zone P=0.000 1; marginal zone P=0.000 1). The bFGF gene expression in infarction region of BMMNCs and MSCsgroups were higher than those in AMI model and shamoperated groups (P=0.000 1), that in margion zone of MSCs group were higher than that in AMI model, BMMNCs and shamoperated groups ( P=0.009 1). The LVEF had a negative correlation with cadiocyte apoptosis (r=-0.441 1，P=0.027 3) and NFκB (r=-0.579 6，P=0.000 6); and a postive correlation with the numbers of blood vessels (r=0.775 0, P=0.000 3）and bFGF (r=0.573 5, P=0.016 1) and VEGF expression (r=0.565 1，P=0.018 1). ConclusionsThe improvement of cardiac function relates to the increased blood vessels, enhanced VEGF and bFGF expressions, decreased apoptosis and NFκB levels. The cardiac muscle vessels proliferation promoted by BMMNCs are more than that by MSCs, VEGF expressions are higher in margion zone of BMMNCs group than that in MSCs group. The bFGF expression in MSCs group is significantly higher than that in BMMNCs group. 1 d5 X) |9 m6 z2 I$ A5 ^: a
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　　【Key words】Bone marrow mononuclear cells (BMMNCs); Mesenchymal stem cells (MSCs); Cellular transplant; Acute myocardial infarction (AMI); Ventricular remodeling

　　近年来，许多学者正在致力于通过骨髓干细胞移植的方法来修复急性心肌梗死（AMI）后受损的心肌细胞。研究表明〔1，2〕：干细胞移植可以使AMI后的左室射血分数提高，整个左心室几何形状明显改善，左室重构减轻。但其机制目前尚不完全清楚。可能与心肌再生、血管生成、心肌细胞凋亡减少、改善心肌、基质以及血管重构等多种途径共同起作用〔1～3〕。本研究经冠脉自体骨髓单个核细胞（BMMNC）和间充质干细胞（MSCs）移植，系统观察了胶体金标记的移植细胞在心肌内的再生情况、心肌内血管内皮生长因子(VEGF) 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和核转录因子NFκB以及心肌细胞凋亡的变化。旨在于观察干细胞移植对AMI左室重构的影响，探讨干细胞移植预防左室重构的机制。

　　1材料与方法& x+ \$ T9 v7 V9 t
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　　1.1骨髓干细胞提取及标记
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　　1.1.1BMMNC的提取及标记采用梯度密度离心法分离BMMNC。以氯胺酮200 mg在小型猪臀部肌注麻醉，以右侧股骨为穿刺点，常规消毒后抽取骨髓40 ml，与等量肝素盐水混匀，加入淋巴细胞分离液，在18℃、2 000 r/min离心20 min。离心后分为三层，吸取上、中两层液面交界处如钱币厚度的白色BMMNC层，注入15 ml的离心管中，加4倍于BMMNC液量的生理盐水，混匀后离心10 min。离心后BMMNC沉淀于离心管底部,加Hank′s液洗涤2次(1 400 r/min)。加入10 ml含10%小牛血清和5%胎牛血清的DMEM培养液中，之后加入等量胶体金溶液，吹打，制成细胞悬液。在37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。收集细胞，无血清DMEM洗涤2次，加入无血清DMEM 10 ml，制成单细胞悬液，以6108骨髓BMMNC备用，进行BMMNC移植。) r( A; Z& N2 r0 O4 S4 l

　　1.1.2MSCS培养及标记①MSCs的原代培养：利用贴壁法分离培养MSCs，将收集的BMMNC放入离心管中，加入 PBS 溶液4 ml，冲洗吹打。18℃条件下以 1 000 r/min离心5 min，重复离心3次。以全培养基重复冲洗过程2次。按照 5105个/cm2进行分瓶，每个培养瓶加到5 ml定容，放入37℃、5%CO2和饱和湿度的孵箱中培养。②骨髓MSCs的传代培养：培养液pH值为7.2，CO2浓度为5%。培养48 h后首次换液，之后每3 d更换一次培养液，去除非贴壁细胞，待细胞生长达到80%融合时，加入传代消化液(0.25%胰蛋白酶 0.02鞹A)使之均匀铺满瓶底，于37℃消化5～10 min在倒置显微镜下观察消化情况，细胞变圆后加入0.5 ml胎牛血清中止消化。吸除消化液，加入全培养基，用无菌吸管吹打使细胞脱落。将细胞悬液移至15 ml离心管，400 r/min离心5 min，吸弃上清液，加入10 ml全培养基，吹悬细胞。然后以3105个/cm2的密度接种于T50培养瓶进行传代扩增。第4代骨髓MSCs培养48 h后，更换胶体金标记培养液继续培养12～16 h(等量2倍浓度M199培养液加入等量胶体金溶液，再加入20%胎牛血清)。收集细胞，无血清DMEM洗涤2次，加入含100 u/ml肝素的无血清DMEM10 ml,制成单细胞悬液，以备移植。2 m2 J  M. ~  s7 v
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　　1.2小型猪急性心肌梗死后心力衰竭模型的建立与分组实验用36只冀中白猪(由河北省医学科学院动物中心提供)，随机分为4组：对照组（6只）、单纯梗死组（AMI组，10只）、BMMNC移植组（10只）、MSCs移植组（10只）。对照组只进行假手术处理，AMI模型组经球囊封闭前降支（LAD）中段制成AMI模型后饲养至28 d。BMMNC组，在AMI模型制成后经OTW球囊移植骨髓BMMNC，饲养至28 d。MSCs组，制成AMI模型90 min后经OTW球囊移植MSCs，饲养至28 d。

　　1.3心功能检测分别于术前及术后28 d，由同一专科医生行心脏超声检查，记录心脏各房室腔径、室壁厚度和室壁运动情况，应用Teichholtz公式计算左室射血分数和短轴缩短率。) d) c6 b4 B% K4 I8 t, Q

　　1.4血管计数分别于梗死区、梗死边缘区常规病理取材、石蜡包埋、HE染色，每张切片在200倍高倍视野随即观察三处进行血管计数(个/0.2 mm2)。有一个中心腔的圆形或类圆形结构计数为一个血管。每只动物以梗死区及梗死边缘区血管计数总数的均数与LVEF行相关性分析。
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　　1.5心肌细胞凋亡计数采用原位缺口末端标记法(TUNEL)进行心肌细胞凋亡检测，试剂盒由博海生物技术有限公司提供。TUNEL阳性反应为细胞核呈棕褐色或棕黄色颗粒，若细胞核呈TUNEL阳性反应且具备细胞凋亡的形态学特征则被判定为凋亡细胞。在每张玻片上随机取10个区域，每个区域计数100个细胞中凋亡阳性细胞数，平均后即为凋亡细胞的阳性率。每只动物以梗死区及梗死边缘区心肌细胞凋亡计数总数的均数与LVEF行相关性分析。) i! }, k# }4 y, M4 `

　　1.6心肌VEGF和bFGF的检测采用实时RTPCR方法〔4〕于AMI后28 d分别在梗死区、梗死边缘区及正常心肌区取材，检测心肌VEGF、bFGF mRNA的表达。每只动物分别以梗死区及梗死边缘区心肌VEGF、bFGF mRNA的表达量总数的均数与LVEF行相关性分析。, _) u% @, p: ^1 {5 P
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　　1.7心肌组织核因子κB阳性率的检测应用图像分析系统，光学显微镜放大400倍摄取图像，输入图像分析系统内。每张切片随机选取10个区域，计算每个区域中染色部分占整个区域面积的百分比，以均值表示心肌中阳性信号面积。每只动物以梗死区及梗死边缘区心肌组织核因子κB阳性率数的均数与LVEF行相关性分析。

　　1.8统计学处理采用SAS6.12统计软件，计量资料以x±s表示，进行左室射血分数与血管数、VEGF、bFGF、心肌细胞凋亡、心肌组织NFκB间的相关性分析研究。

　　2结果

　　2.1心脏功能的变化36只猪完成了冠脉造影，AMI模型及细胞移植组同时完成了PTCA球囊封堵术，28 d后共有31只成活。其中对照组存活6只、心肌梗死模型组、及MSCs组各存活8只、BMMNC组存活9只。5只动物死亡，心肌梗死模型组及MSCs组各死亡2只，BMMNC组死亡1只，3只于冠状动脉LAD内球囊加压过程中诱发室颤死亡，另外2只于AMI模型制成后24 h内猝死。- G& U+ s0 z: Z7 p2 s  e3 I) [

　　经心脏超声检查，术前四组之间左心室收缩末内径、左心室舒张末内径、左心室射血分数、左心室短轴缩短率均无统计学差异。术后28 d，对照组、BMMNC组、MSCs组(EDD)均明显低于单纯心肌梗死组，EF及FS均明显高于单纯梗死组，对照组、BMMNC组、MSCs组三组间相比上述指标无显著性差异（见表1及表2）。

　　表1术前及术后28 d心脏ESD及EDD的变化（略）
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　　ESD与对照组、BMMNC及MSCs组相比：1）P＜0.01

　　表2术前及术后28 d心脏EF及FS的变化（略）

　　与对照组、BMMNC及MSCs组相比：1）P＜0.01( A" w% ?) s* t+ m( A' d: W
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　　2.2干细胞移植后心肌血管数的变化及其与心功能的关系

　　2.2.1血管数的变化①梗死区及梗死边缘区的血管数：AMI模型组、BMMNC组及MSCs组比正常组血管数增加；BMMNC移植组血管数比梗死组及间充质组增加，有非常显著性差异（梗死区F=34.87，P=0.000 1，边缘区F=29.56，P=0.000 1）。②正常心肌区：梗死组、BMMNC及MSCs组正常心肌区的血管数比正常组血管数增加；BMMNC移植组及MSCs组血管数比梗死组增加，有非常显著性差异（F=14.74，P=0.000 1）（见图1）。; j6 P0 G7 w: ^' Y! n

　　2.2.2BMMNC移植后，心功能与心肌血管数的相关性：LVEF与心肌血管数呈正相关。相关系数r=0.775 0,P=0.000 3,回归方程为：y=33.124 1 0.106 9x，其中y代表LVEF值，x代表心肌血管数。MSCs移植后，心功能与心肌血管数的相关性：LVEF与心肌血管数呈正相关，相关系数r=0.543 7,P=0.029 5，回归方程为：y=32.211 5 1.031 4x。其中y代表LVEF值，x代表心肌血管数。# D; D+ k: N. s2 C' R, I0 {9 @, a
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　　2.3干细胞移植对心肌细胞凋亡的影响及其与心功能的关系3 j) t/ c$ K. J3 v* D

　　2.3.1心肌细胞凋亡情况①梗死区：单纯梗死组、BMMNC组、MSCs组梗死区心肌细胞凋亡率比正常组的凋亡率增加，有非常显著差异(F=14.31,P=0.000 1)；单纯梗死组、BMMNC组、MSCs组间心肌细胞凋亡率差别无显著性意义（图2）。②梗死边缘区：单纯梗死组、BMMNC组、MSCs组心肌细胞凋亡率比正常组的增加，差别有非常显著性意义(F=35.34,P=0.000 1)；BMMNC组及MSCs组心肌细胞凋亡率比单纯梗死组降低，差别有非常显著性意义；BMMNC组及MSCs组之间心肌细胞凋亡率差别无显著性意义（图3）。③正常区：单纯梗死组、BMMNC组心肌细胞凋亡率比正常组的增加，差别有非常显著性意义(F=5.33,P=0.005 2)；MSCs组与正常组相比细胞凋亡率差别无显著性意义（见图2，图3）。

　　2.3.2心功能与心肌细胞凋亡的相关性AMI 28 d时，左室射血分数与心肌细胞凋亡（梗死区、边缘区、正常心肌区的均数）呈负相关（r=-0.441 1，P=0.0273），直线回归方程为：y=63.125 1-40.623 7x。
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　　2.4干细胞移植对心肌VEGF及bFGF表达的影响及其与心功能的关系/ h1 m# \/ M: l6 F4 t5 [
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　　2.4.1干细胞移植对VEGF基因表达的影响①心肌梗死区及梗死边缘区VEGF基因表达:单纯梗死组、BMMNC组及MSCs组的梗死区以及梗死边缘区的VEGF基因表达量与对照组的相比增加，差异有非常显著性意义（梗死区F=20.11,P=0.000 1;梗死边缘区F=49.41,P=0.000 1)；BMMNC组梗死边缘区VEGF基因表达量比单纯梗死组及MSCs组的升高有显著性意义；MSCs组与单纯梗死组相比VEGF基因表达无显著差异。②正常区VEGF基因表达：单纯梗死组、BMMNC移植组以及MSCs移植组的正常区的VEGF基因表达量与对照组的相比提高，差异有显著性意义（F=9.37,P=0.000 2）。单纯梗死组、BMMNC移植组以及MSCs移植组组间相比无显著性差异。1 x; e- p1 e! a/ M& W( m$ p2 f

　　2.4.2干细胞移植对bFGF基因表达的影响①心肌梗死区bFGF基因表达:BMMNC及MSCs移植组，心肌梗死区的bFGF基因表达量比单纯梗死组及对照组均显著增加，差别有非常显著性意义（F=23.69,P=0.000 1）；BMMNC及MSCs移植组之间，单纯梗死组及对照组间bFGF无显著差异。②心肌梗死边缘区bFGF基因表达：MSCs移植组，心肌梗死边缘区的bFGF基因表达量比单纯梗死组、BMMNC组及对照组的均显著增加，差别有非常显著性意义（F=4.71,P=0.009 1）。③正常区bFGF基因表达：BMMNC及MSCs移植组，正常区的bFGF基因表达量比对照组增加，差别有非常显著性意义（F=7.02,P=0.001 3）；MSCs移植组与单纯梗死组相比差别有显著性意义；单纯梗死组与对照组相比，差别无显著性意义。$ A" C3 K& V. Y$ I2 T4 W0 O$ ~

　　2.4.3BMMNC移植后心功能与心肌VEGF及bFGF表达的相关性①心功能与心肌VEGF表达的相关性：移植后28 d，检测单纯心肌梗死组及BMMNC组LVEF与心肌梗死区、边缘区的VEGF表达，并进行LVEF与梗死区、边缘区的VEGF表达的相关性分析。结果：LVEF与VEGF表达正相关。相关系数r=0.565 1，P=0.018 1。回归方程为：y=45.959 8 133.381x。其中y代表LVEF值，x代表心肌梗死区、边缘区的VEGF表达的均数。②心功能与心肌bFGF表达的相关性：移植后28 d，检测单纯心肌梗死组及BMMNC组LVEF与心肌梗死区、边缘区bFGF的表达，并进行LVEF与梗死区、边缘区的bFGF表达的相关性分析。结果：LVEF与bFGF表达正相关。相关系数r=0.573 5,P=0.016 1。回归方程为：y=49.503 8 98.211 9x，其中y代表LVEF值，x代表心肌梗死区、边缘区的bFGF表达的均数。
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　　2.4.4MSCs移植后心功能与心肌VEGF及bFGF表达的相关性检测干细胞移植后，MSCs组LVEF与心肌梗死区、边缘区VEGF及bFGF的表达，并进行LVEF与梗死区、边缘区的VEGF及bFGF表达的相关性分析。结果：LVEF与bFGF表达正相关。相关系数r=0.585 7,P=0.017 1。回归方程为：y=49.283 98.837x，其中y代表LVEF值，x代表心肌梗死区、边缘区的bFGF表达的均数。
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　　2.5干细胞移植对心肌组织NFκB的影响及其与心功能的关系; ?' ^$ j, m" f( L6 d. `
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　　2.5.1干细胞移植后心肌NFκB的变化①单纯梗死组、BMMNC组、MSCs组的心肌梗死区的NFκB阳性率与对照组相比无显著差异(F=1.02，P=0.397)；②单纯梗死组、BMMNC组、MSCs组的心肌梗死边缘区的NFκB阳性率与正常组相比均显著增加(F=19.05,P=0.001)；BMMNC组及MSCs组NFκB阳性率比单纯梗死组显著降低；BMMNC组、MSCs组间NFκB阳性率无显著性差别。③单纯梗死组、BMMNC组、MSCs组的正常区NFκB阳性率比正常组NFκB阳性率显著升高(F=8.67,P=0.003)；单纯梗死组、BMMNC组、MSCs组的正常区NFκB阳性率差异无显著性意义。各组心肌组织NFκB免疫组织化学检测结果（见图4，图5）。

　　2.5.2心功能与心肌NFκB的相关性左室射血分数与心肌组织NFκB（梗死区、边缘区的均数）呈负相关(r=-0.579 6，P=0.000 6)，直线回归方程为：y=68.793 0-1.123 4x。! e& R3 T: I: U2 w9 P: X

　　2.5.3心肌细胞凋亡与心肌组织NFκB的相关性心肌细胞凋亡与心肌组织NFκB呈正相关(r=0.702 7，P=0.000 1)，直线回归方程为：y=-0.039 5 0.015 5x。与对照组相比：1）P＜0.01；

　　与对照组相比：1）P＜0.01；' W% w8 a' a+ I  \% b) Z

　　与AMI和MSCs组相比：2）P＜0.01；

　　与对照组相比：1）P＜0.01；

　　与AMI组相比：2)P＜0.01

　　图1各区血管数变化与对照组相比：1）P＜0.01! h7 T) i: Z, ~! P. Y/ P( f

　　与对照组相比：1）P＜0.01；与AMI组相比：2）P＜0.014 p. \- M1 d8 I' e% h6 C! Q7 W
- n, p! @9 J+ Q7 C
　　与对照组相比：1）P＜0.01
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　　图2各区心肌细胞凋亡梗死组（略）  ?" [  W8 \- N7 I

　　BMMNC组MSCs组
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　　图3各组边缘区细胞凋亡(200)（略）$ c: T9 @% O$ Q3 V1 C& `; E. O8 i

　　与对照组相比：1）P＜0.01　　与AMI组相比：2）P＜0.01
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　　与对照组相比：1）P＜0.01
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　　图4各区NFκB梗死组（略）. [2 |6 i. b3 B, G' N6 |# Q

　　BMMNC组MSCs组

　　图5各组边缘区NFκB表达(200)（略）# T- R+ v5 |0 q3 t- c7 b4 }5 r* f

　　3讨论

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　　AMI后心脏的修复过程主要包括炎症反应、细胞增殖、结缔组织形成、创面收缩和创面重构几个阶段。炎症反应是心室重构的始动环节，AMI后，血小板释放趋化因子吸引巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞趋化至心肌梗死部位。巨噬细胞分泌多种细胞因子，刺激成纤维细胞的有丝分裂和新生血管的形成〔6〕。2001年Orlic首次报道将骨髓干细胞成功的移植到心肌梗死动物模型〔8〕，随后Strauer等首次将骨髓干细胞应用于临床治疗，发现接受干细胞移植的心肌梗死患者心脏受损面积缩小、心功能明显改善〔7〕。骨髓干细胞移植后，对心肌梗死后炎症反应的影响报道较少。有研究发现：用G动员后，AMI患者C反应蛋白的水平升高，提示加重炎症反应〔8〕。但Takaoka研究发现：干细胞移植并未加重AMI后的炎症反应，在AMI加血管损伤及单独血管损伤，干细胞移植后可在血管内膜和中层生长，但并未加重AMI后的因炎症反应引起的血管增生〔9〕。NFκB是与炎症反应有关的即早基因的表达调控关键因子之一，NFκB与抑制蛋白IκB结合在胞浆中呈非活化状态。在刺激因子作用下,与IκB解离而活化,并迅速核移位,与特异性κB结合而启动靶基因转录,分泌白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞黏附分子、干扰素等炎性介质,产生急性炎症反应。本研究发现，AMI后，NFκB表达显著增加。而BMMNC及MSCs移植后，对心肌梗死区及正常区NFκB表达无明显影响。但可显著降低梗死边缘区NFκB的表达。表明BMMNC及MSCs移植可减轻梗死边缘区心肌的炎症反应，从而减轻心室重构和血管重构。
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　　1999年，Tomita等〔10〕成功通过5氮胞苷的作用，使大鼠骨髓多能干细胞分化为类心肌细胞，并移植到液氮冷冻后制成的心肌癍痕组织中。研究发现移植细胞可分化为类心肌细胞并表达心肌特异蛋白肌钙蛋白I，同时有血管生成，形成了富含血管的心肌组织。但是，近来干细胞的横向跨系分化行为受到质疑。干细胞是否具有横向分化能力是基础和临床研究两个领域中最大的争议。有研究并未发现干细胞与宿主细胞间形成结构和功能上统一的电机械复合体，在细胞移植后发生恶性心律失常，甚至猝死。Weissman〔11〕将干细胞植入大鼠心脏后并未发现分化现象，Verfaillie〔12〕认为目前所见分化现象是来源于成体组织中残存的胚胎样原始干细胞而非成体干细胞，而有研究者〔13〕则提出所谓骨髓干细胞的分化表现，其实是干细胞与胚胎干细胞融合后产生胚胎样细胞，而否定成体干细胞的可塑性理论。

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　　更多的研究表明：干细胞可诱导分化为有功能的心肌组织〔14〕，取代坏死及无功能的心肌，传递信号分子，通过控制受体细胞基因的表达，使受体心肌细胞去分化，重新进入增殖周期，减少心肌细胞凋亡。移植后新生的细胞维持了受损心肌的相对完整性，限制了心室特别是梗死区膨展，抑制了心脏重构；移植细胞增加了心脏的顺应性和弹性，使心室壁富有弹性从而限制了梗死区膨出。本研究，利用胶体金标记的干细胞进行移植28 d后，在电镜下发现梗死边缘区有胶体金标记的细胞生长。提示，干细胞移植后可在心肌梗死的边缘区生长。干细胞移植后可分化为内皮组织细胞和血管平滑肌细胞〔15〕，形成新的毛细血管，建立侧支循环，并分泌血管内皮生长因子、细胞因子，促进毛细血管新生和先前存在的血管系统增殖，改善宿主血液供应，减少心肌细胞凋亡。Kamihata〔16〕对猪的缺血心肌模型予以MBMNCs移植，28 d后猪的心室收缩功能明显改善，血管造影术显示侧支循环的数目增加，新生毛细血管与宿主血管网相通，心脏成纤维生长因子、VEGF的mRNAs的水平上调。Matsumoto〔17〕等研究表明：骨髓干细胞移植不仅有新生的心肌细胞替代缺血细胞，还有干细胞分化为内皮组织细胞和血管平滑肌细胞，该细胞在心肌组织中又分化形成新的毛细血管，建立侧支循环，并分泌血管内皮生长因子、细胞因子等物质，促进毛细血管新生和先前存在的血管系统增殖，改善宿主血液供应，减少心肌细胞凋亡，促使梗死恢复，进而改善心室重构。本研究发现：BMMNC及MSCs移植后可增加梗死后心肌血管数量，BMMNC增加血管数的作用强于MSCs移植。移植后心功能的改善与血管数的增加及心肌VEGF、bFGF表达增加有关。
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　　心肌梗死后通过诱导肿瘤坏死因子受体家族和转化生长因子受体等凋亡受体，与各自的配体相互结合后激活下游的信号转导，激活caspases家族诱发细胞凋亡。BMMNC及MSCs移植后，干细胞因子的分泌增加。干细胞生长因子可抑制磷酸肌醇激酶3途径抗凋亡。 Yoon研究发现，人类骨髓来源的多能干细胞移植后可在大鼠的梗死心肌内存活，并表达肌肉和内皮细胞特征，对整体心脏功能的改善、缩小心肌梗死面积、增加心肌血管密度、减少细胞凋亡〔18〕。国内马东星等在AMI大鼠的心肌梗死区及边缘区注射BMMNC治疗，发现细胞移植组比单纯梗死组心功能显著提高，TUNEL法心肌细胞凋亡指数显著降低〔19〕。本研究发现：BMMNC及MSCs移植后，心肌细胞凋亡减少，心功能的改善与心肌细胞凋亡减少有关。
      【参考文献】) u, e3 g5 A- B# Q' D( m3 H/ }2 s
　　1  Ohnishi S，Yanagawa B，Tanaka K,et al.Transplantation of mesenchymal stem cells attenuates myocardial injury and dysfunction in a rat model of acute myocarditis〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2007；42(1):8897.

　　2  Nakamura Y，Wang X，Xu C,et al.Xenotransplantation of longtermcultured swine bone marrowderived mesenchymal  stem cells〔J〕.Stem Cells，2007；25(3):61220.

$ I( g" ~3 D1 e

　　3  Grigoropoulos NF，Mathur A.Stem cells in cardiac repair〔J〕.Curr Opin Pharmacol,2006；6(2)：16975.
% r8 m, \5 K6 ?* `& W! L( D
8 o  I& j3 t. G) _. D( S
) D; x6 c2 v* a/ V0 {
　　4  李树仁，齐晓勇，史力生，等.经冠脉移植骨髓单个核细胞和间充质干细胞治疗急性心肌梗死的对比实验研究〔J〕.中国老年学杂志，2006；26(10)：1299304.

　　5  Oren H，Erbay AR，Balci M,et al.Role of novel mediators of inflammation in left ventricular remodeling in patients with acute myocardial infarction：do they affect the outcome of patients〔J〕? Angiology,2007;58(1):4554.3 m9 u/ q% j+ t8 D

　　6  Orlic D，Kajstura J，Chimenti S,et al.Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium〔J〕.Nature,2001；410(6829):7015.

! q: `# Q% g6 I4 v' I2 t: m
, k' J$ J& D& W/ Y2 h0 G. l, h$ I
　　7  Strauer BE，Brehm M，Zeus T,et al.Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow stem cell transplantation in human〔J〕.Circulation，2002；106(15):19138.2 w* L; U& S# c* C& |+ R

5 u$ s% B' \0 G0 ^" f

　　8  Deng Z，Yang C，Deng H.Effects of GMCSF on the stem cells mobilization and plasma Creactive protein levels in patients with acute myocardial infarction〔J〕.Int J Cardiol，2006；26;113(1):926.* ~( R# Y( ?. e
4 @$ b6 d" B4 Y) U  f, D; [
9 E' ^- L# u  k# m4 L' Q; A+ S: R
1 Q; t# z4 [2 T! E$ G# a9 T
　　9  Takaoka M，Uemura S，Kawata H.Inflammatory response to acute myocardial infarction augments neointimal hyperplasia after vascular injury in a remote artery〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006;26(9):20839.

　　10  Tomita S,Li RK,Weisel RD.Autologous transplantation of  bone marrow cells improve damaged heart function〔J〕.Circulation,1999；100(19):24756.4 n9 x  l, D7 l7 I9 ~6 A
/ ]1 i. p, S8 {9 q8 L: ]

　　11  Weissman IL.Normal and neoplastic stem cells〔J〕.Novartis Found Symp，2005；265:3550.
# x2 C) X# \0 \9 }. H4 T. u* D
3 O, J) u. N: S% P; q/ [; i  ]
" o' W% a, N  h$ Y/ ?8 @8 _
　　12  Verfaillie CM.Stem cell research：future implications for internal medicine〔J〕.Acta Clin Belg，2005；60(5):27783.

: ~. B3 w9 U9 G9 b& M. f. }
　　13  Singh AM，Li FQ，Hamazaki T.Chibby，an antagonist of the Wnt/betacatenin pathway，facilitates cardiomyocyte differentiation of murine embryonic stem cells〔J〕.Circulation，2007；115(5):61726.
' e2 L  @1 @8 n2 [; H

　　14  Min JY，Chen Y，Malck S，et al.Stem cell therapy in the aging hearts  of  Fischer 344 rats:synergistic effects on myogenesis and angiogenesis〔J〕.J  Thorac Cardiovasc Surg，2005；130 (2):54753.: S) M/ f+ t$ _9 L% {3 m& X. v  b' f# U  o
8 [0 Z* V3 f  }" A
. L; G' S% R! y, S
7 ~, |4 v" D$ G- g% m: [
　　15  Kamihata H，Matsubara H，Nishiue T,et al.Improvement of collateral perfusion and regional function by implantation of peripheral  blood mononuclear cells into ischemic hibernating myocardium〔J〕. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002；(11)：180410.* A% A9 l; ?4 y7 T" P

, f$ T' s! @" u) K( i/ M& v
+ c. ]  a. ]* ~! M0 b* a4 K3 r! t
　　16  Kinnaird E，Stabile MS，Burnett,et al.MarrowDerived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms〔J〕.Circ Res,2004；19(3)：67885.  v! G6 A$ @! c3 O
% p/ L5 E. x; C2 t5 a  }( S/ V$ W4 G

　　17  Matsumoto R,Omura T,Yoshiyama M,et al.Vascular endothelial growth factor expressing mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005；25(6):116873.9 q* a0 k7 ~% @, ]7 Q5 Z  Y

/ F3 J1 \9 `& o0 U7 b
　　18  Yoon YS,Wecker A,Heyd L,et al.Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction〔J〕.J Clin Investi，2005；115(2)：32638.7 p) i4 N) R/ f9 _0 r/ o& K
1 ^; j$ A: k+ j# R. E, U
6 p1 h2 m4 v* F3 W
0 Y) D. _- B' S* w$ _
　　19  马东星，张永珍，谢道银，等.骨髓细胞移植对心肌梗死后大鼠心肌细胞凋亡及Bcl2、Bax表达的调节〔J〕.中国介入心脏病学杂志，2004；12（5）：3014.

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