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作者：万建美，张玉龙作者单位：214400 江苏江阴，江阴市第三人民医院检验科
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【摘要】 目的 探讨2型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus 2, rAAV-2）载体能否有效地转染NSCs。方法 采用含有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）报告基因的rAAV-2（rAAV-2/EGFP），以感染复数（multiplicity of infection, MOI）分别为1×104、1×105、1×106转染体外分离、培养的大鼠胎鼠NSCs，在荧光显微镜下观察EGFP的表达；同时检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况来评估对其存活、增殖、分化能力的影响；当EGFP表达稳定后，流式细胞仪检测rAAV-2/EGFP对NSCs的转染效率。结果 转染10天后各转染组便可观察到NSCs克隆球发出绿色荧光，起始荧光强度不一，随MOI值的增大而增强；各转染组荧光强度随时间的延长而逐渐增强，至转染21天后达高峰并维持，此时流式细胞仪检测rAAV-2对NSCs的转染效率：MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%, 荧光指数（FI）分别为4.08、12.72、14.06；转染组和未转染组细胞培养7、14、21天时其细胞活力、增殖倍数、分化差异均无显著性。结论 rAAV-2能有效地转染NSCs，所介导的目的基因能高效表达。
; |$ C8 b0 J8 X/ z% N& F 【关键词】神经干细胞；2型腺相关病毒；转染；感染复数；绿色荧光蛋白；荧光指数；细胞活力7 `3 w3 Y8 T" x5 ?* `
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The experimental study on transfection efficiency associated recombinant adenovirus 2 in cultured neural stem cells
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WAN Jian-mei,ZHANG Yu-long,ZHANG Hai-jun.Department of Laboratory,The Third People′s Hospital,Jiangyin214400,China0 N, Y6 [: A* T4 G9 L h9 f }
5 i, x, i3 i& r【Abstract】ObjectiveTo investigate the transfection efficiency of recombinant adeno-associated virus 2 （rAAV-2） in cultured neural stem cells.MethodsThe neural stem cells of rat embryo cultured, indentified in vitro was infected with the rAAV-2 expressing the enhanced green fluorescent protein（EGFP） gene by different multiplicity of infection（MOI=0,1104,1105,1106 ）. After transfection, the expression of EGFP was detected by fluorescent microscope. At the same time, the cytotoxicity of rAAV-2 to NSCs was evaluated by cell proliferation, cell vitality and cell differentiation. The tranfection efficiency was evaluated by flow cytometer.ResultsEGFP was initially expressed in the neural stem cells-drived neurosphere of all transfected groups 10d following infected by rAAV-2/EGFP.The level of expression increased with the increase of MOI, subsequently gradually increased and reached peak on 21d.Transfection efficiency and fluorescent index （FI） were 25.68%, 4.08 （MOI=1104）; 50.60%, 12.72 （MOI=1105）; 56.72%, 14.06 （MOI=1106） respectively. During the period of the culture, cell proliferation, cell vitality and cell differentiation in the transfected and untransfected group had no difference.ConclusionsThe rAAV-2 can transfect neural stem cells efficiently, and the rAAV-mediated transfer of the gene can be expressed in the NSCs.3 o/ e' d! I$ _4 A3 Z7 t k( G
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【Key words】neural stem cells；recombinant associated adeno virus 2;transfection; multiplicity of infection;green fluorescent protein; fluorescent index；cell vitality
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' Q' m, C4 j+ E N; {+ F6 U/ X: w绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一种新的报告基因，由于其表达产物GFP可被直接激发产生荧光，不需要任何底物或辅助因子，较传统的标记基因如β2-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等更具有明显的优越性；在GFP的基础上进行F64L和S65T的突变从而形成增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP），EGFP增强了GFP的荧光性能，更容易观察、检测［1］。2型腺相关病毒具有与人类疾病无相关性、宿主范围广、可整合入细胞染色体DNA介导外源基因长期表达等优点,是较理想的基因载体［2］。随着神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的分离、培养、纯化及生物学功能研究深入［3～5］，寻找NSCs基因修饰载体及标记分子，已成为研究NSCs在体内、外分化调控和细胞工程基因治疗中枢系统疾病的研究热点。运用基因修饰神经干细胞治疗中枢系统疾病具有细胞修复和转基因治疗的双重优势。理想的基因转移载体是基因修饰的关键。$ M& i1 u9 t& f
' F ]9 ^7 n4 p4 S+ q: B9 B1 I$ J1材料与方法
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1.1病毒载体rAAV-2/EGFP购于863生物领域病毒基因载体研究开发基地、北京本元正阳基因技术股份有限公司，滴度为51011v.g/ml。
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7 p! r: \; ^. A+ z! E9 n) g; |1.2神经干细胞分离、培养、鉴定［6］按参考文献进行，体外分离胚胎大鼠大脑额叶皮质、悬浮培养，经Nestine鉴定为神经干细胞（见图1），作为实验细胞株。
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1.3主要试剂、仪器DMEM/F12培养液、胎牛血清（HyClone公司产品）；表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）（SIGMA公司产品）；兔抗巢蛋白Nestin抗体、罗丹明标记山羊抗兔二抗（北京中杉金桥公司产品）。相差倒置显微镜（Cannon）、倒置荧光显微镜（Nikon）、细胞计数板、CO2培养箱、超净台、流式细胞仪（BD）。
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/ S; t, L1 X/ D! w1.4rAAV-2/EGFP体外转染神经干细胞/ S3 `2 K2 s% `' r, G d' G6 _% M
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1.4.1分组取生长良好的NSCs，机械反复轻柔吹打分散、200目不锈钢筛网过滤制备成单细胞悬液，以1105个细胞/孔接种于4块6孔培养板中，分别按感染复数（MOI）（v.g/cell）=0、1104、1105、1106转染，设四组，其中MOI=0作为未转染对照组。
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6 V$ v B# s. Q1.4.2转染转染时先按MOI值计算所需加入rAAV-2/EGFP病毒载体的体积数，在试管中将所需加入rAAV-2/EGFP病毒载体与DMEM/F12培养液混合形成转染液，将每组对应孔中加入相应的2ml转染液，MOI=0作为未转染对照组，同样操作但不转染rAAV-2/EGFP，37℃，5%CO2培养箱培养2h后，1000r/min离心5min，如此DMEM/F12清洗细胞2次，弃病毒残液，补充完全细胞培养液（DMEM/F12加2 |
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发表于 2009-3-3 12:02
发表于 2015-7-3 08:18
