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作者：陈嘉作者单位：广州中医药大学 & r' |# j' r4 v3 S) ]# K* a* N
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, d$ T% F6 d: ?/ {$ v 【摘要】 目的：体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），并研究中药单体丹酚酸B诱导MSCs向心肌样细胞分化. 方法：用贴壁培养法分离、培养、纯化MSCs，免疫荧光法检测细胞抗原CD44和CD34. 分别用含5 μmol/L的5氮胞苷（5aza）和30 mg/L丹酚酸B的低糖DMEM培养液培养MSCs 24 h后，RTPCR法检测培养1，7，14和21 d心肌特异性转录因子NKX2.5，GATA4和心肌特异性蛋白αactin mRNA的表达， 用免疫荧光法检测诱导后αactin的表达情况. 结果：获得纯化的MSCs，免疫荧光检测细胞表面标记CD44呈阳性，CD34呈阴性. 诱导后细胞形态逐渐发生变化. RTPCR显示NKX2.5和GATA4 mRNA在MSCs有基础性的表达，而分别以5aza和丹酚酸B处理24 h后，NKX2.5和GATA4 mRNA表达增强，7 d时表达达高峰，以后维持在高水平，与空白对照组相比，有统计学差异(P* a& B4 l# T- \$ M0 J; g0 }& `* E: X
【关键词】骨髓间充质干细胞 细胞培养 丹酚酸B 心肌细胞
4 H- K+ B% V' ^9 O1 e! x 0引言2 ]9 o) A$ B' m7 |6 s$ n7 ]
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当前，细胞移植作为一项极具开创性意义的治疗方法及技术用于改善心功能及心肌活力已受到广泛关注. 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)存在于骨髓基质中，由于MSCs取材方便、操作简单、增殖能力强，且具有干细胞的多向分化潜能，可被诱导成为间充质来源的多种成体细胞［1-3］等特点，被称为是组织工程最具应用前景的一种干细胞，将MSCs诱导分化为心肌细胞来修复死亡的心肌组织，具有一定的临床意义.
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% }/ A! l3 f" O% I/ OMSCs向心肌细胞定向分化需要一定的诱发因素. 体外研究大多学者都使用5氮胞苷（5 Azacytidine，5aza）作为诱导剂对MSCs进行诱导分化为心肌细胞. 然而作为一种白血病化疗药物，5aza会残留在细胞DNA中［4］，因此诱导后的移植细胞潜在的生物安全性令人担忧. 而中药具有临床应用安全和长期有效的特点，许多中药制剂、单味中药及中药单体都具有诱导细胞分化成分. 丹酚酸B是丹参水溶性成分中最主要的活性成分，具有和一些诱导剂（如β巯基乙醇、DMSO）相似的抗氧化作用，因此开展丹酚酸B诱导MSCs分化有一定的开创性.6 q, t/ X$ a" T3 z8 l8 J1 i
: {) `6 C0 J$ I6 R1材料和方法
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. _- j7 z+ A: m. C$ D$ w1.1材料实验动物：SD大鼠，雄性，体质量90~100 g，由广州中医药大学实验动物中心提供. 主要试剂：DMEM培养基（GBICO/BRL）,胎牛血清（奥地利PAA）,丹酚酸B（广州市药检所，标准品）,5aza(Sigma),兔抗大鼠CD44多抗（博士德）,兔抗大鼠CD34多抗（博士德），CY3标记的羊抗兔IgG（博士德）,Hoechst33342 (Sigma),AllPrep RNA/Protein Kit（Qiagen）,OneStep RTPCR Kit（Qiagen）.; G* Q0 X% ]$ {$ m
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1.2方法
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1.2.1MSCs分离、培养无菌条件下取大鼠股骨，以含150 mL/L胎牛血清的DMEM 培养液冲洗髓腔，以5109个/L接种. 当细胞接近80%铺满瓶底后，以2.0108个/L细胞的密度接种于传代培养瓶中进行扩增培养. 取第3代的MSCs进行实验.
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1.2.2MSCs鉴定
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1.2.2.1形态学鉴定相差显微镜下观察细胞形态，拍照.6 |" y& q5 R4 \0 D" D
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1.2.2.2免疫荧光鉴定MSCs种于盖玻片上，步骤如下：多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗3次，每次3 min. 加入含5 mL/L Triton X100和50 mL/L BSA的 PBS， 30 min后用PBS洗3次，每次3 min. 加一抗兔抗大鼠CD44（1∶100）, 兔抗大鼠CD34（1∶100）多克隆抗体，各100 μL，放入湿盒内4℃过夜. 用PBS 冲洗3次，每次5 min. 加入荧光二抗Cy3IgG（1∶100），室温下避光孵育30 min后，用PBS冲洗3次，每次5 min. 加10 mg/L的Hoechst 33342溶液，放入湿盒内37℃避光孵育10 min. PBS清洗3次，每次3 min. 在激光共聚焦显微镜下观察并拍照. 对照片滴加PBS代替一抗，其余相同." b4 c) |3 ^ X2 o
. t4 d% u: G, f4 h @1.2.3丹酚酸B诱导MSCs向心肌样细胞分化将对数生长期的P3 MSCs以2.0108个/L接种于6孔板内，每孔1 mL. 待细胞生长至亚融合状态（约第3日），将细胞分为3组，每组8个孔. A组细胞用MSCs完全培养基、B组细胞用终浓度为5 μmoL/L的5aza培养基、C组细胞用含丹酚酸B 30 mg/L的培养基共同培育24 h后，吸弃培养基，用PBS清洗3次，加入MSCs完全培养基继续培养. 分别在诱导1，7，14和21 d后收集细胞，提取细胞总RNA，检测浓度后进行RTPCR检测NKX2.5, GATA4, αactin mRNA的表达.
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2 F0 A( m. V5 E, V提取总RNA作为模板，经电泳鉴定其完整性后，利用紫外分光光度计测定A260与A280的比值，并计算其浓度. 设βactin为内参照. 取40 mg/L的RNA，反应体系为25 μL，循环参数：95℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共33循环进行RTPCR. 取5 μL RTPCR产物，经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用凝胶成像系统扫描分析NKX2.5, GATA4, αactin基因与内参βactin的光吸收比值. 进行3次独立实验. RTPCR引物用primer premier 5.0软件设计，序列为Nkx2.5的上游引物CAGAACCGCCGCTACAAG，下游引物AGTCCCCGACGCCAAAGT，预期大小325 bp；GATA4的上游引物CTGTCATCTCACTATGGGCA，下游引物CCAAGTCCGAGCAGGAATTT，预期大小257 bp；αactin的上游引物GGAGAACCACAGGCATTG，下游引物CATCGGGAAGTTCGTAGC，预期大小297 bp；βactin的上游引物AGAGGGAAATCGTGCGTGAC，下游引物AGGAGCCAGGCAGTAATC，预期大小353 bp.
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7 \- T2 W9 i/ Q. n! n) Z统计学处理：实验数据用SPSS 13.0统计软件进行处理，均数间比较使用单因素方差分析及LSDt检验，方差不齐用秩和检验.+ x0 i& i3 h0 H
: s3 Q" r# T* x2结果
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2.1细胞形态观察原代培养1 d后， 可见MSCs呈长梭形贴壁生长并散在分布(图1A)， 7 d后， >80%的细胞克隆融合， 可传代. 传代后， MSCs在2 h内贴壁生长， 无潜伏期， 克隆状增殖， 细胞形态较一致， 多为长梭形， 呈“旋涡”样生长(图1B)， 5~6 d可再传代.
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2.2免疫荧光鉴定MSCs细胞呈CD44阳性，见胞质呈红色（CY3），胞核呈蓝色（Hoechst33342）（图1C）；而CD34呈阴性，胞质未见红色，仅见胞核呈蓝色（图1D），阴性对照片也仅见蓝色的胞核.5 O4 ~- b/ M! E' D. }( k
2 Y" W# _8 T% t. Z8 n2.3诱导后细胞形态的变化细胞诱导前呈长梭形（图2A），30 mg/L的丹酚酸B诱导1 wk后，形态逐渐发生变化，细胞体积增大，呈球形或棒状（图2B），诱导14 d左右细胞相互融合，形成肌管样结构（图2C），诱导21 d肌管样结构明显增多，部分细胞聚集，形成一个球形的聚集物（图2D）. 5aza组的细胞的变化过程和丹酚酸B组相似.
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2.4丹酚酸B诱导MSCs向心肌样细胞分化过程中相关基因表达的变化RTPCR扩增基因片段后，20 g/L琼脂糖凝胶检测到NKX2.5和GATA4 mRNAA: 原代培养1 dMSCs 200;B: 传代MSCs 200; C: CD44阳性1000; D: CD34阴性1000.表1NKX2.5 mRNA的RTPCR产物的相对光密度值5 T f2 R3 G3 R' P) \" c
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现在还没有发现MSCs的特异表面分子［5-6］. 目前认为MSCs表达SH2, SH3, SH4, CD9, CD10, CD29, CD44, CD51, CD54, CD58, CD59, CD61, CD62, CD80, CD90, CD102, CD106, CD120, CD121, CD123, CD126, CD127, CD140, CD147, CD166，但它不表达造血谱系特异的表面分子，如CD14, CD34, CD38, CD45等. 实验通过多次传代纯化MSCs，并通过免疫荧光法检测了第3代MSCs的CD44和CD34，结果显示CD44呈阳性，而CD34呈阴性，进而鉴定了MSCs.表2GATA4 mRNA的RTPCR产物的相对光密度值
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l w/ G/ S" t发生生物学的研究表明NKX2.5, GATA4等心肌细胞特异性的基因在心肌发生中扮演重要角色，是胚胎干细胞向心肌细胞分化的重要启动基因［7-10］. NKX2.5基因在心肌细胞分化前就开始表达，是心脏发生中最早表达的转录因子，心脏前体细胞分化的最早标志物. GATA4基因也是心脏前体细胞的最早期标志之一，调节心肌细胞的发生、分化及心脏前体细胞形成线状心管. 本实验发现，NKX2.5, GATA4基因在诱导前有不同程度的弱表达，可能是因为这些基因在体内各组织器官表达的广泛性. 这些基因在诱导后1 d表达开始增强，7 d时达高峰，诱导后7 d MSCs形态即发生变化，14 d时心肌细胞重要结构蛋白αactin显著表达，开始具有心肌细胞的表型. 在丹酚酸B诱导MSCs分化为心肌细胞的过程中推测丹酚酸B促进了这两个基因的表达，从而促进心肌细胞结构蛋白的表达.
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丹酚酸B的诱导骨髓MSCs分化心肌细胞机制目前尚未清楚. 推测，丹酚酸B在诱导MSCs转变为心肌样细胞中的作用估计与其影响心肌细胞相关调控基因(包括GATA4, NKX2.5)和(或)改变骨髓基质微环境，分泌某些细胞诱导因子有关，但确切机制尚有待于进一步探讨. 而MSCs的分化机制研究是当前MSCs研究的重点和难点，如果在该方面取得突破性进展，将对MSCs的临床应用产生深远的影响.2 I5 m) g& O: r5 r/ B$ f2 @
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