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发表于 2009-3-3 12:03 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：杨镇军，陆东风*，欧念文，胡德喜作者单位：（广州医学院第二附属医院心内科，广州  510260） 6 n* |$ x  ?! q/ @9 T+ B


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      【摘要】  目的  了解新生小鼠心肌干细胞（cardiac stem cells，CSCs）在体外的分化潜能，为重建缺血及坏死心肌的临床应用提供依据。方法  采用组织块贴壁法体外培养小鼠CSCs，以免疫磁珠细胞分离（MACS）系统纯化原代细胞。纯化所得细胞分别予4个浓度的粒细胞集落刺激因子（GCSF）进行诱导，应用流式细胞术（FCM）、免疫荧光染色（IFS）鉴定细胞表型，RTPCR检测心肌转录因子GATA4与心肌结构基因βMHC的表达。结果  由组织块培养所得的原代细胞经FCM、IFS检测证实其部分表达Sca1 和CD 45。采用MACS成功得到高纯度的细胞，行FCM、IFS鉴定其表型为Sca1 /CD 45－，RTPCR检测显示其表达GATA4，不表达βMHC。纯化的细胞予诱导后培养3周，整个培养过程未见单个或成团细胞的自发搏动。诱导后3周各组细胞再次经FCM检测见Sca1的表达均比诱导前减弱，RTPCR检测见诱导后的细胞仍然不表达βMHC。结论  应用MACS后成功得到高纯度的表型为Sca1 /CD 45－的CSCs；CSCs Sca1的表达量可能随培养时间的延长而下降；GCSF未能将CSCs诱导分化为心肌细胞。
      【关键词】心肌干细胞；  粒细胞集落刺激因子；  心肌再生# _: P( q5 \, W) d/ r
   Differentiation of Cardiac Stem Cells Induced by GCSF in Vitro/ M7 B- I& [% V! f5 U4 h

YANG Zhenjun，LU Dongfeng，OU Nianwen，HU Dexi+ R- B# J6 X7 w
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（Department of Cardiology，Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College，Guagnzhou 510260，China.）

Abstract： ObjectiveTo investigate the differentiate potential of cardiac stem cells （CSCs）isolated from neonatal mice，and provide a scientific basis for the clinical application to reconstruct ischemic and necrotic myocardium.MethodsCSCs were cultured in vitro and were purified by magnetic cell separation （MACS）system.The purified cells were respectively induced with four different concentrations of granulocyte colonystimulating factor （GCSF）Flow cytometry （FCM）and immunofluorescence staining （IFS）were performed to identify cell phenotype.Reverse transcription polymerase chain reaction （RTPCR）was performed to detect the expression of cardiac transcription factor GATA4 and cardiac structural gene βMHC.ResultsFCM and IFS showed that the primary cells partly expressed both Sca1 and CD 45.High purity cell fraction was successfully obtained by MACS，and FCM and IFS showed that its’ cell phenotype was Sca1 /CD 45－.RTPCR analysis indicated that the purified cells expressed cardiac transcription factor GATA4，but not cardiac structural gene βMHC.The purified cells were induced with GCSF and cultured for three weeks.During the process，neither single cell nor agglomerate cells synchronized contraction was observed.Three weeks after the induction FCM was again performed，and an express reduction of Sca1 in all five groups was observed.Cardiac structural gene βMHC still not detected in the induced cells by RTPCR.ConclusionHigh purity cell fraction which phenotype is Sca1 / CD 45－ was successfully obtained by MACS system.An express reduction of Sca1 may associate with the prolongation of cell culture period.GCSF could not induce CSCs into cardiomyocytes.

Key words：Cardiac Stem Cells； GCSF； Myocardial Regeneration, y0 w; a6 c5 w- K; F
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2003年，Beltrami AP等[1]首次证实CSCs的存在。这种细胞具有自我更新、形成克隆和多能性的特征，并能分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。将这些细胞注入缺血心脏后，这些细胞或其子代细胞能重建具有新生血管及肌细胞分化良好的心肌。随后有学者的研究发现CSCs能够穿越血管屏障再生梗死的心肌，改善心功能[2]。因此，CSCs理论上是一种有效的心肌修复工具，但实际上在心肌损伤或梗死后心脏的自我修复能力却相当有限，这提示了CSCs的心肌修复作用受到某种机制的限制。另外，由于CSCs在心脏中的数量稀少，而且在心脏中的增殖速率及激活途径都不十分明晰，因此在缺少一个或多个有效刺激因子的情况下CSCs有可能维持其干细胞的形态及稳定的细胞数量。自CSCs被发现，先后有学者用5AZA、催产素[3]、高迁移率组box 1 蛋白（highmobility group box 1 protein，HMGB1）[4]和FGF（fibroblast growth factor）[5]等刺激因素作用于CSCs希望能促进其增殖或分化成为心肌细胞，当中不乏有成功的研究。GCSF作为一种干细胞动员剂广泛地应用于科研和临床，其不但能动员骨髓来源的干细胞[6]和外周血干细胞[7]归巢到心脏参与心肌修复，而且在猪的缺血再灌注模型中其还能促进心肌血管生成及减少纤维化[8]。因此，本实验遂选用GCSF作为诱导剂，以探讨GCSF除上述效应外是否还具有将CSCs诱导成为心肌细胞的作用，进一步明晰GCSF心肌修复的作用机理。
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1材料与方法9 Y2 }+ U* S0 @1 s) _; F4 W, d

1.1实验动物与主要试剂采用购自中山医科大学实验动物中心的1～2 d的SPF级新生昆明小鼠用于实验。FITC antimouse Sca1，PE antimouse CD 45，Functional Grade Purified antimouse Sca1，FITC Rat IgG 2a isotype control，PE Rat IgG 2b isotype control（ebioscience公司），Purified antimouse CD 45（BioLegend公司），免疫磁珠分离产品购自Miltenyi Biotec 公司。

1.2CSCs的培养、纯化与诱导将出生1～2 d的小鼠置于75%酒精内消毒后剪取心脏，立即置于预先加有DPBS的培养皿中，予DPBS洗去心脏血污后剪成约0.5～1 mm3的组织块，再次用滴管吸取2～3 ml DPBS反复冲洗至洗涤液澄清。弃去洗涤液加入少量CEM培养液（成份：IMDM，10%胎牛血清，100 u/ml青霉素G，100 μg/ml链霉素，2 mmol/L L谷氨酰胺，0.1 mmol/L 2巯基乙醇）使其保持湿润，然后用滴管吸取少量组织块涂布于培养瓶底部并用滴管尖部轻轻拨散使其均匀分布。将培养瓶竖立放入37℃，5%CO2恒温水浴培养箱中25～30 min，待组织块贴壁牢固而又未干涸时加入CEM培养液（覆盖组织块整体）培养。约24 h后肉眼可观察到组织块贴壁牢固极少脱落，于倒置显微镜下可以观察到其周围已有少量成纤维细胞样细胞爬出，48～72 h后可见开始有小而圆的透亮细胞从组织块爬出。予2～3 d换液1次，观察细胞生长情况。约3周左右，细胞增殖至铺满整个培养瓶底，可进行纯化。弃去培养液，以DPBS液清洗2～3次，加入TrypsinEDTA（0.25% tryspsin，1mM EDTA·4Na）于37℃消化约4 min，镜下可见细胞收缩变圆，立即加入少量CEM培养液终止反应。反复用滴管吸取瓶底液体轻轻吹打培养瓶壁，使贴壁细胞脱落形成细胞悬液。将悬液予200目细胞筛过滤到离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入少量DPBS重悬细胞得到单细胞悬液。所得的细胞悬液在进行细胞标记后采用德国Miltenyi Biotec公司的免疫磁珠细胞分离产品进行富集纯化，分离步骤严格按照产品说明书的指示进行。分离采用两次阳性分选法，首先标记CD 45，去除CD 45 细胞后再予Sca1标记CD 45－的细胞，最后收集到的细胞为Sca1 / CD 45－细胞。收集到的细胞分组培养，空白对照组用CGM培养液（成份：35% IMDM，65% DMEM F12，2% B27，10 ng/ml EGF，20 ng/ml bFGF，40 nmol/L Cardiotrophin1，40 nmol/L thrombin，100 u/ml青霉素G，100 μg/ml链霉素，2 mmol/L L谷氨酰胺，0.1 mmol/L 2巯基乙醇）培养，诱导组则分别用0.4 ng/ml、0.8 ng/ml、1.6 ng/ml及3.2 ng/ml 4个浓度的GCSF诱导72 h后继续予CGM培养作为诱导1～4组，予每2～3 d换液1次，并每天于倒置显微镜下观察细胞生长情况。所有细胞的观察终点相同，为诱导后培养3周。
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1.3免疫荧光染色检测细胞细胞原代培养约3周细胞可长满瓶底，可采用前述方法制成细胞悬液，将细胞悬液移入预先铺有盖玻片（浸泡过多聚赖氨酸）的培养皿中并放回培养箱中进行细胞爬片，24 h后于倒置显微镜下可观察到细胞完全贴壁。弃去培养液，予DPBS振荡洗涤3次，4％多聚甲醛室温下固定15 min，DPBS振荡洗涤3次，滴加经稀释至染色效价为1∶200或1∶250的荧光抗体FITC antimouse Sca1、PE antimouse CD 45，在4℃避光染色过夜，DPBS振荡洗涤5次，弃去洗涤液取出盖玻片予水性封片剂封片，共聚焦显微镜下观察细胞。另外，纯化的细胞亦以上述方法进行细胞爬片及免疫荧光染色。# s$ ~$ V" e; {/ t- ]9 o, l7 W. p
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1.4流式细胞术检测细胞原代细胞增殖至铺满瓶底时，可采用前述方法制成细胞悬液，取细胞悬液，台盼蓝染色后于细胞计数板上计数活细胞数，调整细胞浓度至106个/ml，送流式鉴定。另外，取纯化后诱导培养3周的各组细胞及空白对照组细胞同样配制成浓度为106个/ml细胞悬液，送流式鉴定。检测的细胞表面标志物为Sca1和CD 45。

1.5半定量RTPCR检测取纯化后未诱导及经诱导后培养3周的细胞行半定量RTPCR检测，检测的表达物有GATA4及βMHC。( I; I  c7 h/ O7 e7 k5 M: m& s: q
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1.6统计学处理将诱导后培养3周的细胞经流式细胞仪检测，比较空白对照组细胞与各诱导组细胞表面标记物Sca1表达的差异。所得到的数据以均数±标准差（x±s）表示。应用SPSS 13.0统计软件包进行χ2检验分析，以P＜0.05为差异具有显著性。
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2结果
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2.1细胞生长情况心肌组织块接种到培养中24 h后于倒置显微镜下可观察到有少量成纤维细胞样细胞从组织块中爬出，48～72 h后开始有小圆的透亮细胞爬出。原代细胞一般3周左右可以长满瓶底，培养过程中可见部分小圆细胞伸展变成梭形，呈现小圆细胞与梭形细胞混合生长。纯化的细胞绝大部分为小圆形，小部分为梭形，培养过程中大部分小圆细胞保持其小而圆的形态，但仍有小部分伸展为梭形。各诱导组的细胞亦可见类似上述的现象。; c9 c) [% j3 H& `2 Q
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2.2共聚焦显微镜下免疫荧光细胞图像免疫荧光染色证实，部分原代细胞的表面表达Sca1和CD 45标记。（图2A、C为细胞图像，可见为小而圆细胞与梭形细胞混合生长；图2B中部分细胞表面带有Sca1标记的绿色荧光；图2D中亦可见部分细胞表面带有CD 45标记的红色荧光。）而纯化的细胞高度表达Sca1，几乎不表达CD 45。（图2E、G为细胞图像；图2F中几乎所有纯化的细胞表面都带有Sca1标记的绿色荧光；图2H中只有极个别的细胞表面带有CD 45标记的红色荧光。）
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2.3半定量RTPCR电泳图半定量RTPCR检测诱导前后细胞心肌转录因子GATA4及心肌结构基因βMHC的表达。图3 A与B分别为诱导前、后两基因在细胞中表达的电泳图。（Marker：100～1 500 bp；内参βActing：583 bp；GATA4：275 bp；βMHC：205 bp）& f' B* X5 p6 J; }8 C
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结果显示，纯化后未经诱导的细胞表达GATA4，但不表达βMHC，表明纯化后的细胞极可能为CSCs；经诱导后的细胞仍然不表达βMHC，表明诱导后的细胞并非心肌细胞。3 M. S3 ?! _5 n  ^& K: f% g- r
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2.4流式细胞术结果分析图检测原代细胞Sca1与CD 45的表达情况及纯化后细胞的纯度。对比研究细胞表面标志物Sca1在空白对照组及各诱导组中的差异。图4A、B分别为原代细胞在流式细胞仪中Sca1与CD 45的表达图；图4C为原代Sca1 / CD 45－细胞的流式图；图4D、E分别为纯化细胞在流式细胞仪中Sca1与CD 45的表达图；图4F、G、H、I、J分别为观察终点空白对照组、诱导1～4组细胞在流式细胞仪中Sca1的表达图。0 |1 k; \3 X1 ~. _) E+ U

流式检测结果显示，原代细胞约40％表达Sca1，约30％表达CD 45，而Sca1 / CD 45－细胞只有约27％。经MACS纯化之后，细胞高度表达Sca1，基本上不表达CD 45，Sca1 / CD 45－的纯度可达95％。观察终点的细胞Sca1的表达比诱导前（即纯化细胞）明显下降，但将空白对照组与各诱导组细胞表达Sca1的情况进行对比，发现Sca1在各组中的表达并无显著性差异（对比分析结果见表1）。表1流式细胞术结果统计分析表注：*与诱导1～4组比较P＞0.055 N; T/ w$ e9 T5 {+ z

3讨论8 y  c+ d# b9 }3 D5 [7 |$ z

3.1心肌干细胞的表型选取学者对心肌干细胞（CSCs）的研究表型的选择上不甚一致。本实验选用目前报道较多的Sca1作为标志物，并辅以CD 45进行亚群分类。Sca1是一种干细胞表面抗原，分子量为18 ku磷脂酰肌醇锚定蛋白，Ly6抗原家族的一员，在造血干细胞、上皮前体细胞及多种组织均有表达。近年发在现人类、狗及鼠类的心脏也有Sca1的表达。CD 45是白细胞共同抗原，表达量在成熟淋巴细胞最高，单核细胞、粒细胞、早期造血细胞依次减弱。我课题组已从新生小鼠心肌组织中成功培养及初步分离得到CSCs，流式细胞术检测见原代与传代细胞基本不表达CD 34、CD 8两个标记，排除了该类细胞是造血干细胞、成熟内皮细胞的可能性[9]。我们采用组织块贴壁法培养出的原代细胞经流式鉴定及免疫荧光染色检测后证实其部分表达Sca1与CD 45，应用免疫磁珠细胞分离技术成功得到高纯度的Sca1 /CD 45－细胞，经RTPCR检测后发现其表达心脏转录因子GATA4但不表达心肌结构基因βMHC，实验结果与Hidemasa[10]及Katsuhisa Matsuura[11]的研究结果一致。以上结果表明，本实验所纯化得到的细胞极有可能为存在于心肌的干细胞，即心肌干细胞。/ j' s# ]& t2 ^
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3.2诱导剂的选取粒细胞集落刺激因子（GCSF）是体内骨髓粒系特异性集落刺激因子，可显著促进骨髓粒系造血干细胞增殖分化；显著增加外周血粒细胞数目、活性与寿命；大剂量GCSF尚可动员骨髓各系造血干细胞释放。以GCSF可以提高梗死区域心肌的再灌注[12]及预防心肌梗死后左心室的重塑[13]。GCSF还可缩小心肌梗死面积，改善心射血功能，促进心肌梗死处血管再生及细胞增殖，且对心肌酶学无明显影响[14]。在一项荟萃分析中，结果显示，GCSF的治疗可以提高急性心肌梗死病人的左室射血分数，且病人对这项治疗普遍有良好的耐受性[15]。基于GCSF的上述效应，本研究拟通过以GCSF体外诱导CSCs分化来明确其除作为干细胞动员剂外是否还具有将固有心肌干细胞诱导成为心肌细胞的效应。
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3.3CSCs Sca1表达下降的影响因素我们分别以0.4 ng/ml、0.8 ng/ml、1.6 ng/ml及 3.2 ng/ml 4个浓度的GCSF诱导纯化后的Sca1 /CD 45－细胞，诱导后3周将各组细胞送流式检测可见Sca1的表达均比诱导前下降。诱导前后的细胞有两个不同的影响因素，一是培养时间，二是诱导剂。纯化后未进行诱导的细胞只是从以CGM培养约3周的原代细胞中提取，而空白对照组及各诱导组的细胞在纯化后则分别予CGM和GCSF CGM继续培养3周，各组细胞的培养时间比诱导前的细胞多一倍或有诱导因素参与。但将空白对照组与各诱导组细胞Sca1表达的差异进行比较，发现差异并无统计学意义，这提示了Sca1的表达量的下降与诱导因素无明显关系，而与时间因素关系较大。合理的解释是其可能随培养时间的延长而下降。  @% l! T% c; c; j0 @0 L! _
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3.4GCSF未能将CSCs诱导分化为心肌细胞在GCSF对Sca1 /CD 45－细胞的整个诱导培养过程中未见有单个或成团细胞的自发收缩现象；另外，将诱导后的细胞再次进行RTPCR检测，结果显示其仍然不表达心肌结构基因βMHC。上述实验结果表明，4个浓度的GCSF均未能在体外将CSCs诱导成为心肌细胞。诱导不成功的原因可能与两个方面有关：（1） GCSF的作用方式；（2） CSCs的活化机制。GCSF可通过直接作用于细胞表面的特异性受体，即GCSF受体，及与其他活性因子共同作用于细胞从而产生一系列生物学效应。对于心脏而言，GCSF可以通过作用于心肌细胞表面的GCSF受体，激活心肌细胞内的JakStat信息途径，从而提高心肌细胞的存活力及预防心肌梗死后的左心室重构[16]。但由于目前并无GCSF受体也表达于CSCs的相关报道，所以并不排除GCSF不能直接作用于CSCs。另外，有报道称CSCs具有生长因子受体系统，控制着其迁移及增殖[17]。而体内和体外的心源性分化均依赖于FGF2，此因子并不是通过控制心肌前体细胞的数量而是通过上调分化过程来实现其作用，它控制着固有的心肌前体细胞分化为有功能的心肌细胞[18]。因此，推测FGF也可能通过其受体系统起作用。; B  P2 [; U: j" x
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综上所述，我们用组织块贴壁法培养所得的原代细胞在应用免疫磁珠分离技术纯化后得到的Sca1 /CD 45－的细胞极有可能为存在于心脏中的干细胞，即CSCs，予GCSF作用后并未能将其诱导成为心肌细胞。由于CSCs具有无可比拟的心肌修复作用，所以目前此领域的各国学者均致力于使CSCs增殖、迁移及分化的机制明晰化，以使CSCs能尽早应用于临床。近几年来，大多数研究都有在体外将CSCs扩增后再注入冠脉或缺血心肌周边进而修复受损或梗死心肌的趋势。但若能在心脏原位刺激CSCs增殖与分化，由于不需通过迁移至心脏，且不会产生由移植导致的副作用，则其理论上比干细胞移植要有优势。
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