巨核系祖细胞的体外扩增及应用研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:17 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：林斯，刘莎，孙新，杨默作者单位：广州市妇婴医院，510180 广州；1香港中文大学儿科学系，香港


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      【摘要】  　　如何缩短造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC）移植术后血小板减少的时间，促进血小板恢复，减少出血，是目前造血干细胞移植面临的难题。在巨核细胞系的发育过程中，有多种细胞因子，如血小板生成素（TPO)、巨核细胞生长发育因子（megokaryocyte growth and development factor，MGDF）、白介素（interleukin，IL）-1、IL-3、IL-6、IL-11、血小板源性生长因子（PDGF）、5-羟色胺（serotonin，5-HT）等发挥了重要作用。近年来巨核祖细胞（MKPC）的体外培养、扩增等研究取得了较大进展，发现通过体外有效扩增巨核祖细胞并移植给患者，可以加快血小板恢复，因此其在HSC移植中有十分重要的意义及良好的应用前景。本文将重点就各种细胞因子对巨核系造血作用和MKPC体外扩增及临床应用进行综述。单独以TPO培养扩增，结果产生的CD41 CD61 细胞比例增高，但细胞总数较低。当加入IL-1β，IL-3，IL-6，Flt-3L时，结果显示CFU-MK扩增400倍，CD34 细胞扩增5-22倍。在包括TPO、IL-1β、IL-3、IL-6和Flt-3L的各种细胞因子组合条件下，加入PDGF的扩增效果最好，且PDGF促进各种细胞包括CD34 、CD41 CD61 、CFU-MK的扩增。PDGF对脐血巨核祖细胞数量的扩增起一定作用，且对脐血MK的成熟没有影响。反映PDGF作用于MKPC的增殖。PDGF可能是促进MKPC体外扩增的合适细胞因子。动物实验显示体外扩增产物在NOD/SCID小鼠中植活并分化。在临床可行性研究中，进行自体PBPC移植的10名癌症患者（8名乳癌和2名非霍奇金氏淋巴瘤患者），接受未处理过的PBPC的同时输注了体外扩增的MKPC（1-21×105/kg CD61 细胞）。8名患者接受同一供者的异基因血小板输注，4名输注最高数量培养后MKPC的患者中有2名不需要输注血小板，而回顾性对照组14名患者均需输注血小板。总之，巨核祖细胞能在体外扩增并安全输注予自体移植受者。 5 P0 C4 [/ m8 Y: J
      【关键词】巨核前体细胞；体外扩增；造血干细胞；  造血干细胞移植
   　　Studies on Ex Vivo Expansion of Megakaryocytic Progenitor and Its Application ——Review

　　LIN Si，LIU Sha，SUNXin，YANGMo1

　　Department of Paediatrics，Guangzhou Maternal and Neonatal Hospital，Guangzhou，510180China; 1Department of Paediatrics，The Chinese University of Hong Kong，Hong Kong，China! Y0 ~; t. X9 d' j, {$ y5 [4 X
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　　AbstractApplication of ex vivo expanded megakaryocyticprogenitor cells（MKPC） is a strategy for the treatment of thrombocytopenia after hematopoietic stem cell transplantation. Some growth factorsincluding thrombopoietin (TPO)，megakaryocyte growth and developmentfactor(MGDF)，interleukin (IL)-1，IL-3，IL-6，IL-11，platelet-derived growth factor (PDGF)，and serotonin (5-HT)have been demonstrated to play an important role on the regulation of megakaryocyte/platelet development，the efficient conditions for the expansion of the megakaryocyte (MK) progenitors from hematopoietic stem/progenitor cells were discussed in this review article. TPO alone produced a high proportion of MK progenitors but a low total cell count. The addition of IL-1 beta，IL-3，IL-6 and Flt-3L improved the expansion outcome. The combination of three to five cytokines produced more efficient expansions of hematopoietic stem and MK progenitors. PDGF also enhanced the ex vivo expansion of CD61 CD41  cells and CD34  cells in combination with TPO，IL-1 beta，IL-3，IL-6 and Flt-3L. PDGF is a suitable growth factor to improve the ex vivo expansion of MKPCwithout promoting their in vitro maturation. More importantly，PDGF also enhanced the engraftment of human stem and progenitor cells in NOD/SCID mice. It has been reported that MKPC can be safely administered to autologous peripheral blood progenitor cell transplant recipients. In short，MKPC can be expanded ex vivo and safely applied to autologous transplant.: i, R& D2 M" F$ x2 i
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　　Key wordsmegakaryocytic progenitor； ex vivo expansion； hematopoietic stem cell； hematopoietic stem cell transplantation" I8 o- l/ O) x- ^
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　巨核细胞（megakaryocyte，MK）的生成是一个复杂的生物学过程，包括造血干细胞发育为巨核祖细胞（megakaryocytic progenitors cell，MKPC），MKPC又进一步分化和成熟为MK，并释出血小板［1］。造血干细胞移植已广泛应用于临床治疗恶性及非恶性血液病、实体肿瘤、遗传代谢性疾病、自身免疫性疾病等。在造血干细胞移植中，受者的造血系统经预处理后严重受损，骨髓抑制，血小板减少，且其恢复较慢，易导致出血乃至死亡，需血小板输注以支持。近年来发现体外扩增MKPC并移植给病人可能有助于解决骨髓移植后血小板恢复较慢的临床问题，减少血小板的输注。因此，MKPC体外扩增并输注予移植患者在造血干细胞移植中有良好的应用前景。本文将重点就各种细胞因子对巨核系造血作用和MKPC体外培养、扩增方法及临床研究进行综述。! X. T6 G# y$ T' _
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　　巨核细胞的生长因子
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　　巨核祖细胞主要由血小板生成素（thrombopoietin，TPO）和作用于早期的细胞因子包括Flt-3 ligand (FL)、干细胞因子（stem cellfactor，SCF）、白介素（interleukin，IL）-1、IL-3等调控，MK主要由TPO，IL-11和IL-6调控。FL和SCF是主要作用于造血前期细胞的生长因子，它们的受体Flt-3和C-kit存在于造血干细胞［2］。此外，可能有一个血小板参与的反馈调节机制调控巨核细胞的增殖和血小板的释放以保持外周血小板的稳定。杨默等［3-6］认为，5-羟色胺（5-HT，serotonin）、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、血小板反应蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）等物质可能均是参与该调控机制的重要物质。: [3 T" E6 w- G8 }& g  ]
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TPO促进巨核细胞增殖、分化、成熟和血小板生成。在巨核细胞发生的早期，TPO能促进单核的巨核祖细胞进行有丝分裂变成多倍体［7］。TPO可在体外促进CD34 细胞和巨核系细胞的增殖，产生功能性血小板。体内实验亦证明，TPO能升高小鼠的血小板以及人和鼠的巨核祖细胞数目。实验显示TPO基因剔除小鼠其血小板减少到只有正常值的15％左右［7］。Li 等［8］研究还发现，TPO调控巨核细胞和血小板的数量，但不影响其成熟，可能还有其他因素参与巨核细胞成熟和血小板生成的调节。

5-HT作为细胞生长因子，主要与细胞表面的5-HT受体结合，通过Ras、MAPK通路促进多种细胞的增殖。在巨核系造血的早期，5-HT通过5-HT2B受体促进造血干细胞及巨核系祖细胞增殖分化［3］；而在巨核系造血晚期，5-HT与5-HT2A受体结合，促进一氧化氮合成，可能对血小板的释放有一定的影响。另外，5-HT能够对抗血小板α颗粒内容物TSP-1所引起的巨核细胞凋亡，协同另一内容物PDGF引起的巨核细胞增殖，因此5-HT可能是血小板调节中比较重要的物质。5-HT对巨核细胞增殖的促进作用尚未完全阐明，可能通过如下几个机制：①5-HT和巨核细胞表面的5-HT2B受体结合，启动cyclin D1/ cyclin E/Src/MAPK途径使细胞进入增殖状态;②5-HT促进纤维细胞等骨髓基质细胞增殖和产生TPO，提高局部的TPO浓度，从而正性调控巨核系造血; ③5-HT能够促进造血干细胞进入核酸合成和细胞分裂周期，通过提高造血干/祖细胞的数量刺激巨核系造血［9，10］。
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PDGF作为一个血小板α-粒子内重要的生长因子，除了对成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等组织有生长刺激作用外，对巨核细胞的生长也起促进作用［11-13］。PDGF促进巨核细胞生长作用的机制可能是PDGF通过巨核细胞表面的PDGF受体，激活细胞内信息传递通路，诱导巨核细胞c-fos基因表达和促进有丝分裂，刺激细胞的增殖和集落的形成［4，5］。研究也表明PDGF能显著促进骨髓基质细胞生长，可能是间接地通过增加骨髓基质细胞生成更多相关细胞因子如TPO、IL-3和IL-6等，而起到促进CFU-MK集落形成和细胞成熟的作用［14］。所以PDGF刺激巨核细胞生长的作用机制可能有两个途径：其一是通过PDGF受体的直接作用，激活包括c-fos在内的信号传递因子，促使有丝分裂发生；其二是通过刺激骨髓微环境中的间质细胞产生其他细胞因子而致的间接作用。
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IL-11在巨核细胞的生长中也起促进其有丝分裂的作用。有报道表明，TPO与IL-11一起发挥协同作用，在体外可促进巨核细胞集落的生长和增加巨核细胞的倍体数［15］。研究已经证实，巨核细胞可表达IL-1受体，IL-1β可能直接与IL-1 Ⅱ型受体结合，激活细胞内信息传递通路和转录子NF-E2［16］。IL-1β单独或与TPO联合应用，均能诱导鼠及人类造血干细胞生成CFU-MK。IL-3是一种多集落刺激因子，IL-3与TPO同时存在时，IL-3可加强TPO在巨核细胞生成中促进有丝分裂的作用。IL-6对巨核细胞的成熟也有作用，但对巨核细胞集落形成的促进作用来说，IL-6没有IL-3强。作为早期发挥作用的细胞因子，FL与 SCF能与TPO一起发挥协同作用，刺激巨核细胞系祖细胞的扩增；但FL单独存在时对巨核细胞的生成并无刺激作用，可能是由于巨核细胞上缺乏FL受体所致［2］。
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巨核祖细胞的体外扩增

　　MKPC的体外培养、扩增以及移植给患者以促进血小板恢复的实验起步稍晚。目前实验方法主要以去血浆液体培养体系扩增为主，比较不同细胞因子组合对MKPC的体外培养、扩增效应，可为临床选择合适的扩增方案提供依据。+ h2 g0 S8 j7 C* R! g0 `

　　MGDF(TPO)对CD34 CD41 细胞扩增的促进作用
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　　Gehling (1997)等［17］通过比较应用不同生长因子组合进行骨髓CD34 细胞和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员外周血的MKPC体外扩增效果。发现应用以下5组不同生长因子组合：①SCF/ IL-3/ IL-6/G-CSF;②SCF/G-CSF/ MGDF（megakaryocyte growth and development factor）;③ SCF / MGDF; ④MGDF; ⑤ SCF/ IL-3/ IL-6/ G-CSF/ MGDF培养10天后结果显示：各组中外周血CD34 细胞中的CD41  MKPC的扩增效应均较骨髓CD34 细胞好。在第1组生长因子组合中加入MGDF培养5天，CD41 细胞数均增加。单独应用MGDF组MKPC比例较生长因子组合组高（外周血中占79%，骨髓中占25%），但由于细胞总数减少，故MKPC绝对值减少，在10天培养期间即使在MGDF的作用下外周血MKPC成熟度也无显著改变。然而，骨髓培养第5天后MGDF诱导形成双核细胞和第I阶段MK的重大改变。该实验数据显示，G-CSF动员后外周血CD34 细胞的MKPC系体外扩增较骨髓CD34 细胞有效。CD34 /血小板糖蛋白 (glycoproteins，GP)  MKPC可能是预防和治疗移植后血小板减少时间延长的合适细胞群。Lefebvre等［11］亦应用含有MGDF/SCF/或G-CSF的去血浆培养基培养人CD34 细胞，研究从外周血祖细胞（peripheral blood progenitor cell，PBPC）体外扩增获得MK，充分证明了MGDF/ SCF促进CD34 /CD41 细胞的扩增，但体外MK分化在体内有益于最佳的血小板产生尚不明确。: O" S0 \# n7 J& E' L* n

　　FL，SCF对扩增MKPC作用( L8 _8 q' T% \: A( a

　　Li等［2］应用脐血CD34 细胞，比较FL (FL/ IL-3/IL-6/TPO)和SCF (SCF/IL-3/IL-6/TPO)不同组合对MKPC体外液体培养扩增的效果。结果显示脐血CD34 细胞在其作用下均显著扩增为MKPC(CD41 CD61 细胞)（图A、B）。作用7天为较理想的时间，MKPC (CD41 CD61 )分别为（18.5±5.61）%( FL组)和（15.7±4.50）%( SCF组)。作用第14天，分别为（15.6±5.05）% (FL组)和（9.78±2.93）% (SCF组)。另外，CD34 细胞和CFU-MK集落均显著增加。比较FL和SCF两组，无论是全细胞数和CD34 细胞，或是CD41 CD61 细胞和CFU-MK，FL组的作用均强于SCF组。研究表明，脐血CD34 细胞在TPO和其他相关细胞因子作用下可有效地扩增为MKPC，而且FL结合TPO、IL-3、IL-6的组合优于SCF结合TPO、IL-3、IL-6的组合。

　　PDGF对扩增MKPC作用' ]. i% W4 P( a1 @+ _" p' k$ |1 |

　　Su 等［12］应用富集的脐血CD34 细胞，单独以TPO培养扩增，结果产生的CD41 CD61 细胞比例增高，但细胞总数较低且细胞凋亡增加，扩增效果不理想。当加入TPO/IL-1β/IL-3/IL-6/Flt-3L时，结果显示CFU-MK扩增400倍，CD34 细胞扩增5-22倍。在包括TPO、IL-1β、IL-3、IL-6和Flt-3L的各种细胞因子组合条件下，比较加入PDGF 50ng/ml与未加入PDGF扩增后细胞CD61、CD41的表达以及MK多倍体的分布，并用CFU-MK对扩增后细胞进行功能检测。结果表明：扩增后第14天，以PDGF/TPO/IL-3/IL-6/Flt-3L组合的扩增效果最好，且PDGF促进各种细胞包括CD34 、MKPC (CD41 CD61 )、CFU-MK的扩增。扩增的大多数CD61 细胞为2N（86.5%），4N（11.8 %），>4 N（1.69%），MK多倍体的分布不受PDGF的影响。实验数据显示，PDGF对脐血MK数量的扩增起一定作用，且对脐血MK的成熟没有影响。反映PDGF作用于MK分化的早期，而对后期的成熟无影响。PDGF可能是在临床应用上促进MKPC体外扩增的合适细胞因子。8 U/ }3 f5 L7 S
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　　IL-9是培养MK的增强剂

　　Fujiki等［13］研究IL-9对人巨核祖细胞的扩增和分化作用。外周血CD34 IL-6R-细胞分别单独或联合应用IL-9、EPO、SCF、TPO进行分类、培养，研究单一或混合巨核细胞集落的数量、单-巨核细胞集落的大小、巨核细胞多倍体的分布及血小板形成。实验结果显示除了TPO外没有一种单一细胞因子能使CFU-MK集落生成。但IL-9、EPO和SCF中任意两个细胞因子组合均能生成少量CFU-MK集落。而EPO/ SCF/ IL-9所诱导的CFU-MK集落数量是联合其中任何两个所诱导的4-6倍。此外，应用TPO或联合应用EPO/ SCF/ IL-9，TPO/EPO/ SCF/ IL-9更有效扩增MK生成。实验结果证明，人IL-9在EPO和（或）SCF存在的情况下促进了人巨核细胞生长，是培养MK的一种增强剂。

MKPC的体外培养、扩增实验已积累了相当丰富的经验，目前主要在去血浆液体培养基中加入各种细胞因子，以骨髓、脐血及G-CSF动员外周血CD34 细胞进行培养，使MKPC获得明显扩增［18］。其研究重点在各种细胞因子组合上，较为有效的细胞因子是TPO (MGDF)、PDGF、IL-1、IL-3、IL-6、Flt-3L，将它们进行组合后在MKPC的体外培养、扩增中取得了显著效应［2，12，16］。5-HT能够促进造血干细胞进入核酸合成和细胞分裂周期，也刺激巨核系体外扩增［9］。
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　　体外扩增巨核祖细胞移植的动物实验1 r2 v- U  _: b  R# \+ k5 |
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　　体外扩增脐血（cord blood，CB）造血干/祖细胞使细胞数增加，可以减轻移植后中性粒细胞减少和血小板减少的严重程度并缩短其时间。Lam等［19］通过研究生长因子、去血浆媒体和自体血浆在CB细胞扩增中的应用和将扩增的产品移植给非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷（nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency，NOD/SCID）小鼠，为临床建立适用的培养体系。富集的CB CD34 细胞分别在4种媒介［Iscove’s modified Dulbecco’s medium with FCS (Gibco); X-Vivo-10 (BioWhittaker); QBSF-60 (Quality Biological) and StemSpan SFEM (Stem Cell Technologies）］中及应用4种细胞因子组合（TPO/SCF/FL/有或无G-CSF/和（或）IL-6）进行培养，同时研究自体CB血浆的作用，于第8天及第12天评价。经过最优化条件的扩增后，所培养的细胞移植予经亚白血病剂量照射的NOD/SCID小鼠。检测骨髓、脾脏、外周血中人CD45 细胞及其亚型的植入情况。结果QBSF-60或Stem Spam SFEM产生较多早期祖细胞（CD34 细胞≤64.8倍；CD34 CD38-细胞330倍；多向祖细胞CFU-GEMM 248倍）和CFU-GM 407倍和红系（BFU/CFU-E 144倍）。X-VIVO-10组MKPC系扩增始终较高，CFU-MK细胞 684倍。自体血浆促进集落形成但CD34 细胞和CFU-GEMM减少了。添加G-CSF或IL-6均能促进祖细胞生长，而G–CSF对祖细胞更有效。在QBSF-60与细胞因子培养的扩增产物在NOD/SCID小鼠中植活并分化为髓系与淋巴系。实验数据显示应用最优化条件可应用于临床扩增以防止或减轻移植后血细胞减少症。

　　体外扩增巨核祖细胞移植的临床研究
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　　Bertolini 等［20］分别应用低密度(low-density，LD)或CD34 细胞通过去血浆体系培养扩增，获得最佳结果的是应用了MGDF/SCF/IL-3/IL-6/IL-11/FL/MIP-lalpha的组合。LD细胞的扩增效果比CD34 细胞差。应用阴性筛选法预富集的CD34 细胞较阳性筛选法预富集的CD34 细胞能产生更大量的MKPC数。MKPC扩增的高峰期在培养第7天，CD34 /CD61 细胞扩增8±5倍，CFU-MK扩增17±5倍，CD61 细胞扩增58±14倍。在可行性临床研究中，进行自体PBPC移植的10名癌症患者（8名乳癌和2名非霍奇金氏淋巴瘤患者），接受未处理过的PBPC的同时输注了体外扩增的MKPC［（1-21)105/kg CD61细胞）］。8名患者接受同一供者的异基因血小板输注，4名输注最高数量培养后MKPC的患者中有2名不需要输注血小板，而回顾性对照组14名患者均需输注血小板。细胞培养中未发现有不良反应及细菌感染。结果显示MKPC能于体外扩增并安全输注予自体移植受者。进一步临床试验将预示将来可能自体移植不再需要异基因血小板输注。- d2 X) \& y* I5 O1 g) w8 Z9 U2 p0 `

既往已有多篇文献对MKPC的体外液体培养、扩增、鉴定方法作过较详尽的报道，但目前仍有许多未知领域等待人们去寻找答案，如：细胞因子对MKPC体外扩增的机制尚未完全清楚；体外扩增培养MKPC最佳的细胞因子组合；体外扩增MKPC输注予动物体内的效应如何；输注的时机、细胞数、最大有效性、可行性及安全性；通过体外扩增MKPC并输注予人自体PBSC移植的临床应用经验尚不足，需进一步验证，尤其在异基因外周血干细胞移植、骨髓移植、脐血移植方面尚未有临床报道。相信随着通过对MKPC体外培养、扩增方案的不断完善，将其安全广泛的应用于临床治疗一定会成为现实，从而使更多患者受益。
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