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本帖最后由 nhzxcsc 于 2010-7-23 09:36 编辑 W5 M! S/ I% [
+ V. f! x' ?8 t$ n2 y; W7 \7 n0 D6 C最近在做人胚胎干细胞特异抗原的表达，是做的免疫荧光，一共八个抗体信息分别如下：9 Z. u3 t! W" L6 S% D) h
直接荧光标记:
0 S0 ~8 z# `7 w" |SSEA-3：PE标记 激发波长488nm，最大发射波长575nm 发红光（说明书：）% |* d1 i9 z& f4 g! E9 |2 p# |
SSEA-4：PE标记 激发波长488nm，最大发射波长575nm 发红光（说明书：）
) a5 F7 }& Z8 V, l& y5 @TRA-1-60：PE标记 激发波长488nm，最大发射波长575nm 发红光（说明书：）
) I4 r% N( O) v/ k, d9 V, |, CTRA-1-81：PE标记 激发波长488nm，最大发射波长575nm 发红光（说明书：）, t' O8 }) k- z0 z& ]+ h& F
7 F, n/ r0 K* B. t+ \! D0 P! L
实验步骤：7 M0 x, h5 M; R( o; z
* ?5 U! W7 O( Y3 A2 Z
1、PBS洗三遍，5-10min/次 " O& C. p& b* ]
2、0.1%Triton X-100/PBS室温处理细胞1h 3 P& i8 n# \) P$ k. V/ \( x2 a) W' r, P
3、PBS洗两遍，5-10min/次 % j/ v, u% N, d2 w
4、3%BSA室温封闭阻断1h ; D2 H4 F1 J8 \! U1 V
5、弃去封闭液，加荧光标记抗体， 6孔板每孔加500ulPBS，再加一抗20ul，摇晃混匀，避光孵育30min-1h
; n, J4 X8 U0 C- ?4 k; `" s6、弃去抗体，PBS洗三遍，5-10min/次 , J# u3 |2 u; p3 F# I( C
7、加少许PBS覆盖细胞，DAPI染核，3min。激光共聚焦显微镜观察并拍照记录
/ k/ |$ h0 e$ b, s& }
$ u4 A# H% s9 t间接荧光标记：
K4 l }0 c }; \2 w5 J u$ uOct-4： 1:100 兔抗（说明书：）
$ M! a( I6 {- P* c4 U4 q: [α-fetoprotein（AFP）： 1:100 鼠抗（说明书：）$ ^: \2 B6 V p t1 J6 e
smooth muscular α-actin： 1:20 兔抗（说明书：） K7 T+ R2 ~# n3 k y; a$ ~& c. Z
β-tubulin Ⅲ： 1:10 兔抗（说明书：）) Y8 ?' w; A1 w# U* N
二抗浓度：抗兔：1:200-500
6 y5 N* ~: _1 s4 r0 H' m 抗鼠：1：500-1000
C3 @' C/ K. g) b3 N _/ ^* [2 g1 y i j W% C1 v
实验步骤：5 s* G' H1 m2 M1 @; U
1、PBS洗三遍，5-10min/次 ) O. G+ V! t3 V3 t
2、0.1%Triton X-100/PBS室温处理细胞1h 3 s' B" z U, p" y2 |5 d
3、PBS洗两遍，5-10min/次 7 \% }0 n# ?: C/ l
4、3%BSA室温封闭阻断1h
6 F! `* n- C2 q9 n' Q5、去除3%BSA，不洗，直接加一抗,4℃过夜 - f3 ~. c6 h9 U5 b# }& o
6、PBS洗三遍，5-10min/次
/ A, u% u @7 K* e1 B: }1 D7、加二抗，室温孵育1h 5 f. x6 \8 Z `/ L7 v1 n2 ]) e& m
8、PBS洗三遍，5-10min/次,DAPI染核，3min。激光共聚焦显微镜观察并拍照记录 % Y1 ~' H. O% F; X* o% D
9 d1 X8 \* e( w/ v; g) v3 c
1、请问一下我做的这些抗体分别位于哪里的（核抗原？胞质抗原？膜抗原？）; E$ s7 X# r7 x/ o0 ]2 F2 c4 T6 K' v, U
2、现在我做了几遍发现非指标的几个都做的效果比较的好，但是直标的那几个效果都很差，是不是抗体或者步骤上存在什么问题？ |
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发表于 2010-7-23 09:34
发表于 2010-7-25 05:43
