人脐血干细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:19 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：潘凤华丁新生李晓波丁海霞张炜民邓小萱姚娟 / J; V) I( l% b9 y6 c

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      【关键词】干细胞6 l- n2 u- n" M: |+ x* z
   　　【摘要】目的研究人脐血干细胞（human umbilical cord blood cells，HUCBC）移植治疗脑出血大鼠的效果及HUCBC在出血大鼠脑内的状况。方法采集足月新生儿脐带血60～100ml，分离出其中的单个核细胞，体外培养并予5-溴脱氧嘧啶尿苷（Brdu）标记48h。用VII型胶原酶注入到大鼠右侧苍白球诱导脑出血模型，24h后经尾静脉注射3×10 6 HUCBC入大鼠体内，同时设立生理盐水组及对照组，对移植后大鼠的神经损害严重程度评分（neurological severity scores，NSS），移植后35天杀死大鼠，用免疫组织化学技术研究移植后的HUCBC的存活、迁徙、分化状况。结果HUCBC在体外具有增殖能力;HUCBC移植组大鼠自移植后21天起其NSS显著低于生理盐水组及对照组（P- Z  q3 c+ h6 P
【关键词】人脐血干细胞;移植;脑出血　　Experimental study of human umbilical cord blood cells transplantation for treat-ment of intracerebral hemorrhage in rats
PAN Feng-Hua，DING Xin-Sheng，LI Xiao-Bo，et al.' A! z5 Y7 o& d8 m, U- L/ u, u7 I
　　Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of NJMU，Nanjing210029，China3 K5 t; ]/ F6 \  F" e2 W
　　【Abstract】 Objective To explore the effect of the human umbilical cord stem blood cells（HUCBC）transplantation to treat intracerebral hemorrhagic rats and the status of transplanted HUCBC in the hemorrhagic brain tissue of these rats.Methods HUCBC got from the placenta of full-term babies were cultured and marked with Brdu（5μmol/l）for two days.Intracerebral hemorrhage（ICH）models was induced in rats by injection of VⅡtype collagenase into the right globus pallidus and the HUCBC were transplanted into the tail vein24hours later.Neurological Severity Scores（NSS）tests were undertaken and immunohistochemistry method was used to check the migration and differentiation of HUCBC in rats.Results The HUCBC had the capacity of proliferation in vitro.Twenty-one days later，the neurological function of rats that received transplantation recovered much better than the rats without transplantation，as evidenced by NSS（P
　　【Key words】 human umbilical cord stem blood cells;transplantation;cerebral hemorrhage
　　脐血中富含造血干/祖细胞，间充质干细胞以及内皮干/祖细胞等，具有较强的增殖、分裂能力，可以向神经细胞方向分化。本实验主要探讨在大鼠脑出血的情况下经尾静脉注射移植人脐血干细胞（human umbilical cord blood cells，HUCBC）的可行性，对中枢神经系统损伤修复的作用和可能的机制。4 r# ]: ^3 d0 _" {" h% K1 L; W% w
　　1 材料与方法
　　1.1 材料1.1.1 动物及分组成年雄性SD大鼠（上海实验动物中心提供）30只，质量270～320g。30只SD大鼠于模型制作过程中因麻醉等原因死亡2只，模型制作不成功4只，其余24只模型制作成功大鼠随机分为（1）对照组（6只）;（2）生理盐水组（9只）;（3）HUCBC移植组（9只）。" E* r$ ?% ~  V1 O7 f
1.1.2 主要试剂与仪器（1）试剂:人淋巴细胞分离液（1.077，天津产），人红细胞裂解液，细胞培养试剂DMEM/F12（1:1，Gibco），B27添加剂（Gibco），5-溴脱氧嘧啶尿苷（Br-du，Sigma），抗菌素-抗真菌复合物（青霉素、链霉素、两性霉素，Gibco），Ⅶ型胶原酶（Sigma）。小鼠抗人巢蛋白（Nestin）单抗（BD公司），小鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体（Chemicon），小鼠抗人胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（Chemicon），抗5-溴脱氧嘧啶尿苷（Brdu）单抗（Sig-ma）。（2）仪器:立体定向仪，超净台，细胞培养箱，Olympus倒置显微镜XDS-18，密度梯度离心机，10μl微量进样器。
　　1.2 方法% Q: v5 I% b2 v) w7 z
1.2.1 制备脐血单个核细胞（mononuclear cell，MNC）悬液参照Ha ［1］等人方法采集脐血单个核细胞，以1×10 6 /ml的细胞密度接种于含10ml DMEM/F12的培养皿中，同时Brdu（终浓度5μmol/l）标记，置于含5%CO 2 的细胞培养箱中培养48h后PBS反复离心洗涤制备密度为6×10 6 /ml的MNC悬液。# w' |+ m2 D8 _4 ~* b9 V
1.2.2 脑出血大鼠模型制作参考Rosenberg等［2］的方法，大鼠麻醉后固定于立体定向仪上，头顶部去毛消毒后正中纵向切口，于前囟偏右旁开3.2mm，向后1.4mm处在颅骨上钻一小孔，用10μl微量进样器进针5.6mm，即苍白球位置［3］，缓慢注入2μl含0.4U胶原酶的生理盐水，留针5min后缓慢拔针，缝合切口。实验动物完全苏醒后，提尾悬空时出血对侧前肢屈曲、内收，自主运动时身体向偏瘫侧转圈，说明模型制作成功。/ @5 k4 \  _. J6 S
1.2.3 HUCBC移植在模型制作成功24h后进行HUCBC移植，将脑出血大鼠装进固定器后，用4.5号头皮针经尾静脉缓慢推入500μl细胞悬液，留针2min后缓慢拔针。生理盐水组用同样方法经尾静脉注入等量生理盐水，对照组未经尾静脉注射。- x% R6 `" A( P/ B/ Z
1.2.4 神经损害严重程度评分（NSS）参照Chen等［4］的方法，分别于移植后1天、7天、14天、21天、28天、35天对HUCBC移植组、生理盐水组及对照组大鼠进行NSS评分，主要观察其运动、感觉功能、平衡能力及生理反射能力;总分为18分，正常为0分，分值越高其神经损害越严重。
1.2.5 免疫组织化学检测于HUCBC移植后35天处死3组大鼠。4%多聚甲醛500ml经左心室灌注后，断头取脑，置4%多聚甲醛后固定24h，冠状位切取以出血区域为中心的包括侧脑室室管膜下区、基底节区和海马的厚度2mm的脑组织标本，石蜡包埋，连续切片，片厚5μm，进行nestin、Br-du、NSE、GFAP免疫组织化学检测，观察移植后的HUCBC的存活、增殖、分化、迁徙情况。
1.2.6 统计学方法 NSS以平均数±标准差（ˉx±s）表示，使用SPSS11.5软件进行数据分析（配对t检验），P
　　2 结果3 f3 t2 ?2 d6 f5 g
2.1 HUCBC具有分裂能力培养两天后于倒置显微镜下可见较多处于有丝分裂相的细胞，分裂细胞占所有细胞比例10%左右。7 ?0 n5 \! L; b$ v4 D6 J# g
2.2 HUCBC移植组、生理盐水组与对照组在移植前后各时间点的NSS比较见表1。HUCBC组在移植前及移植后1天、7天、14天NSS与生理盐水组及对照组比较差异均无显著性（均P>0.05），但第21天、28天、35天移植组NSS明显低于生理盐水组及对照组，差异有显著性（P0.05）。表1 HUCBC组与生理盐水组及对照组移植前后不同时间NSS比较（略）注:与生理盐水组及对照组比较 * P
2.3 移植后大鼠脑内HUCBC免疫组化检测结果移植后35天大鼠脑组织切片中可见Brdu染色阳性细胞分布，以出血侧基底节区、海马以及额顶叶皮质为密集（图1），出血对侧亦可见散在分布的Brdu染色阳性细胞;数量明显少于出血侧。nestin以及NSE染色均呈弱阳性，以出血区域边缘小血管周围多见（图2、3）;GFAP染色阳性的星形胶质细胞（图4）数量较多分布于出血侧基底节区、海马以及额顶叶皮质。生理盐水组及对照组均未见Brdu、Nestin、GFAP及NSE染色阳性细胞。/ W& x3 v( ?$ @: }. r) L. L5 R
3 讨论* Y! ]' Z, o' _* a$ `& J* ]) M
脑出血已成为人类致死致残的最主要原因之一，无论是开颅手术、微创亦或内科保守治疗均不能根本改善脑出血的治疗现状，给社会和家庭带来沉重的负担。近年来对神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的研究为中枢神经系统损伤的修复带来了希望［5］，但因其不易获得且存在伦理学问题，实用性受到极大限制。
脐带血是在足月胎儿娩出之后，经结扎脐带断脐，通过脐静脉穿刺或切开引流收集到的残存在胎盘和脐带中的血液。脐带血中不仅含有丰富的造血干细胞，而且还含有大量的多潜能干细胞，可以向内皮、血管以及神经等组织分化［6］。脐血干细胞用于细胞替代治疗具有来源丰富、采集方便、操作简单可通过静脉注射移植的优点，另外，脐血中的免疫系统处于原始阶段，具有低免疫源性的特点。Bhat-tacharga将174u的脐血全血输注治疗恶性及非恶性血液病患者62例未发生免疫排斥反应［7］。
近年来的研究表明静脉移植HUCBC可显著改善脑缺血大鼠的神经功能［8］，本文作者也做了类似研究并得出了肯定结果（另文报道）。最近Nan ［9］等的研究表明静脉输注HUCBC可减轻脑出血大鼠的功能损害。国内有学者移植HUCBC治疗脊髓损伤大鼠取得满意疗效［10］，但尚未见有HUCBC治疗脑出血方面的实验研究。
本实验用无菌塑料采血袋密闭式采血方法采集并分离人脐血MNC，Brdu标记并培养，两天后发现大约10%的MNC具有分裂能力。HUCBC移植21天后移植组NSS即显著低于生理盐水组及对照组（P3 _# L4 D5 M  P0 @" n  z. O
本实验没有证据表明由HUCBC分化而来的神经细胞能与宿主脑组织整合并参与神经环路的重建。猜测其能显著改善脑出血大鼠神经功能的作用机制可能主要是移植细胞所分泌的营养因子的作用，因为在短时间内植入细胞不可能整合到宿主脑组织中并建立恰当的突触联系。植入的HUCBC含有大量的造血集落形成细胞、血小板生成素和白介素-11，造血集落形成细胞可产生造血因子集落刺激因子-1，这些营养因子是中枢神经系统的生长因子，可促进大鼠损伤局部神经祖细胞的增殖以及分化，抑制细胞凋亡，降低神经损伤，促进功能恢复［8］。
综上所述，HUCBC是一种极具潜力的替代细胞来源，为神经系统疾病的治疗开辟了广阔前景，但植入的HUCBC是否能长期存活并与宿主脑组织整合以及其确切的作用机制还有待深入研究。! m" H; D. e0 N* Z7 _2 p4 G4 e
　　【参考文献】
　　1 Ha Yoon，Choi JU，Yoon DH，et al.Neural phenotype expression of cul-tured human cord blood cells in vitro.Neuroscience，2001，12:3523-3527.
2 Rosenberg GA.collagenase induced intracerebral hemorrhage in rats.Stroke，1990，21:801.
3 包新明，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱.北京:人民卫生出版社，1991，28.* P" Y8 y' {. A. y% E& x0 [
4 Chen J，Li Y，Wang L，et al.Therapeutic benefit of intravenous adminis-tration of bone marrow stronal cells after cerebral ischemia in rats.Stroke，2001，32:1005-1011.
5 潘凤华，李晓波，丁新生，等.人胚神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血的实验研究.临床神经病学杂志，2005，18:84.
6 Ha Y，Lee JE，KimKN，et al.Intermediate filament nestin expressions in human cord blood monocytes.Acta Neurochir（Wien），2003，145（6）:425-427.
7 Bhattacharga N，Mukherijee K，Chettri MK，et al.A study report of174units of placental umbilical cord whole blood transfusion in62patients as a rich source of fetal hemoglobin supply in different indications ofblood transfusion.Clin Exp Obstet Gynecol，2001，28（1）:47-52.
8 Chen J，Sanberg PR，Li Y，et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats.Stroke，2001，32:2682-2688.( d% f- E1 j# y) @
9 Nan Z，Grande A，Sanberg CD，et al.Infusion of human umbilical cord blood ameliorates neurologic deficits in rats with hemorrhagic brain in-jury.Ann N Y Acad Sci，2005，1049:84-96.9 d0 U  o2 Y: x5 w) \
10 Li HJ，Liu HY，Zhao ZM，et al.Transplantation of human umbilical cord stem cells improves neurological function recovery after spinal cord injury in rats.Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2004，26（1）:38-42. + H+ v! C: a  w
　　作者单位:210029江苏南京，南京医科大学第一附属医院（Δ 通讯作者）
　（编辑:黄杰）

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