辛伐他汀对冠心病患者内皮祖细胞增殖的影响及其机制初步探讨 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:19 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：徐全胜　张家明李宾公作者单位：武汉市第一医院心内科，湖北武汉 430030
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      【摘要】  目的：观察辛伐他汀对冠心病患者外周血内皮祖细胞（EPCs）增殖的影响并初步探讨其机制。方法：冠心病患者28例，随机分为辛伐他汀组和对照组，前者给予辛伐他汀40 mg/d口服，治疗前及治疗后2、4周抽取外周血，采用密度梯度离心法获取单个核细胞，培养7 d后对贴壁的细胞进行分析。以激光共聚焦显微镜鉴定为FITC标记的荆豆凝集素Ⅰ和Dil（一种亲脂性碳化青荧光染料）标记的乙酰化低密度脂蛋白双染色阳性细胞为EPCs。计数法比较二组EPCs数目，并对病人血浆低密度脂蛋白-胆固醇(LDL|C)水平和EPCs数进行相关分析。另取10例冠心病患者血培养EPCs，加入辛伐他汀、PI3K/Akt信号转导通路抑制剂Wortmannin后观察对其增殖的影响。结果：辛伐他汀组病人治疗后2周、4周外周血中EPCs明显上升（P005)，体外实验辛伐他汀 Wortmannin组的血EPC数目较辛伐他汀组明显下降（P
      【关键词】辛伐他汀干细胞 PI3K/Akt0 }+ E$ h$ i7 q( U
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Effect and mechanism of simvastatin on the proliferation of endothelial progenitor cells/XU Quan|sheng, ZHANG Jia|ming,LI Bin|gong,WANG Zhao|hui,WANG Xiang//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2007，16（3）：271
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Abstract：Objective:To investigate the effect of simvastatin on the proliferation of endothelial progentior cells (EPCs) and possible mechanism.Methods:The 28 patients with coronary heart disease(CHD) were divided into two groups: simvastatin group and control groupThe former were treated with 40 mg of simvastatin per day for 4 weeks.Before and 2 weeks or 4 weeks after the statin therapy, mononuclear cells were isolated from blood of patients by density gradient centrifugation.Adherence cells were harvested after 7 days culture.EPCs were characterized as adherent cells with double positive for Dil|acLDL|uptake and ulex europaeus agglutinin(UEA) binding by direct fluorescent staining under a laser scanning confocal microscopeEPCs were counted and analyzed.In addition, Liner correlation was used to analyze the relationship between the numbers of EPCs and LDL|C levelsEPCs harvested from other 10 patients blood were incubated with or without simvastatin and Wortmannin, a specific inhibitor of PI3K.Then the proliferation of EPCs was investigated.Results:The number of EPCs significantly increased in subjects with simvastatin in 2 or 4 weeks（P005).The number of EPCs decreased（P# {8 [! F8 m/ Z; z( d; {
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Author′s　address：Department of Cardiology of the First Hospital of Wuhan, Hubei，Wuhan，430022, China3 K& I3 q! u' O$ e2 R, b

Key words：Simvastatin;Stem cells; PI3K/Akt 内皮祖细胞（EPCs）是一类能分化为血管内皮细胞的前体细胞。研究表明，EPCs不仅参与胚胎血管生成，而且在出生后成体血管新生过程中也起了重要作用[1]，新生血管中25%的内皮细胞是由EPC直接分化而来的[2]。正常人外周血循环中有一定数量的来源于骨髓的EPCs，参与维持血管壁的完整性，但冠心病（CHD）病人的外周血EPCs数量减少，功能减低，且这种损害与CHD的危险因素呈相关性[3]，因而研究如何提高外周血中EPCs的数量、功能对于治疗CHD等缺血性疾病可能会提供一种新的思路。本实验旨在观察辛伐他汀在体内及体外对EPCs的影响，并对其机制作初步探讨。
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1 资料与方法' R+ w) m; \' ~7 y3 e3 L

11 主要材料与试剂淋巴细胞分离液（比重1077）购自上海生化试剂二厂，EGM-2-MV内皮细胞培养基购自Clonetic公司，胎牛血清购自GIBCO公司，人纤维连接蛋白购自Chemicon公司；异硫氰酸萤光素(FITC)标记的荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)、Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)均购自深圳晶美生物公司，辛伐他汀购自杭州默沙东公司、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKt）信号通路抑制剂Wortmannin购自sigma公司。2 c! ?: \# |; {5 x& A6 U# U

12 研究对象以冠状动脉造影有≥1支的冠状动脉狭窄>50%为诊断CHD标准，选取28例非急性心肌梗塞的CHD病人，随机分为辛伐他汀组和对照组，每组14人，两组病人临床资料见表1。病人确诊后辛伐他汀组口服辛伐他汀，每日40 mg，其它治疗措施两组无差异。另取10例CHD病人外周血各10 ml，用于培养EPCs后进行体外实验。" S$ d# L9 b/ Y. C% v7 _- q/ i

13 方法

131 辛伐他汀对CHD病人外周血中EPCs数目的影响：每例病人在治疗前、治疗后2周、4周时分别取外周血10 ml，常规密度梯度离心法分离单个核细胞。将单个核细胞以1105个细胞/孔的密度接种在人纤维连接蛋白包被的6孔培养板。加入EGM-2-MV培养基及5黃于5%CO2培养箱中,37℃恒温培养。培养4 d后，用PBS洗脱非贴壁细胞,换液后于第7 d进行检查分析。贴壁细胞用Dil-acLDL、FITC-UEA-Ⅰ行荧光化学染色，激光共聚焦显微镜下观察，染色双阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。每孔随机选择15个视野（200）对EPCs计数。取其平均值换算成每mm2的细胞个数记录。表1 本组冠心病人一般情况
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132 辛伐他汀对CHD病人血清胆固醇的影响：辛伐他汀组病人在治疗前及治疗后4周分别测定其空腹血清中TC、LDL|C的含量。计算治疗前、治疗后LDL|C的差值，并与治疗前、治疗后培养计数所得EPC数值做单因素直线相关分析。8 s5 o0 W' F$ h7 q' @' a
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133 辛伐他汀对培养的EPCs直接作用：10例CHD病人各抽取外周血10 ml按上述方法培养EPCs。培养7 d后对每份样本获得的贴壁细胞随机分3组，A组只加培养液为对照组，B组加入终浓度1μmol/L的辛伐他汀，C组加入终浓度1μmol/L的辛伐他汀及5nmol/L的Wortmannin。继续培养24 h后对贴壁细胞进行Dil-acLDL、FITC-UEA-Ⅰ荧光化学染色后在激光共聚焦显微镜下记数双阳性细胞并进行比较，方法同上。0 a: F- K7 D5 l1 U$ s, b% f
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14 统计分析采用SAS 81 for windows统计软件进行数据处理。实验数据以均值±标准差(±s)表示，组间均数比较用方差分析及q检验，以P＜005为差异有显著性。. _/ U6 B+ A: G1 {5 w+ e) W

2 结果2 K, N7 \  ^( m8 ]5 t1 Y1 A) j
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21 EPCs的鉴定及计数培养4 d后可见贴壁的单个核细胞，7 d后单个核细胞变为内皮样细胞，呈胞梭形。对贴壁细胞行荧光化学染色后，在激光共聚焦显微镜下观察，见>80%的细胞双染色阳性(图1)，说明这些细胞能内吞ac-LDL 和结合UEA-1，可被认为是正在分化的EPCs。对EPCs进行计数比较，可见治疗前两组病人外周血EPCs差异无显著性意义（P>005）,而治疗2周后辛伐他汀组病人EPCs明显多于治疗前（P005）。对照组各时间点所测EPCs数目无明显变化(图2)。% w7 g  @5 R* |* v
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22 直线相关性分析辛伐他汀组病人LDL|C与EPCs的相关系数:治疗前，r=0324（P=0311），治疗4周后，r=0227（P=0528），LDL|C的下降值与EPC的相关系数r=-0176（P=0626），提示辛伐他汀增加EPCs的功能与其降脂作用无相关性。1 `" T  p- N" t; S8 e. ~$ |

23 体外11辛伐他汀对EPCs增殖影响见图3。 EPCs加药后继续培养24 h后，辛伐他汀组(B组)与对照组(A组)比较， EPCs增殖数目明显增加(P005)。注：与对照组比较△△P- J& i' `& ~1 r" F& W: Z
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3 讨论& o0 A6 b; Z: _# j  D1 \; r

　　内皮祖细胞（EPCs）是一群具有游走特征并能进一步增殖分化的幼稚内皮细胞,仅从形态特征上,不能把EPCs识别出来,目前主要依靠细胞表面的分子标记进行识别。它既可表达在成熟内皮细胞表面，如血管内皮生长因子受体Ⅱ（KDR）、血管内皮细胞上特异的酪氨酸激酶型受体（Tie）1 、Tie2受体、VE2钙粘附素等，也可表达在某些造血干细胞表面，如CD34 、AC133等[4]。由于缺乏特有的表面标志,因而目前分离、纯化EPCs具有一定的难度，一般是综合各种标记加以确认。目前比较一致的看法是CD34 、KDR、AC133 （即CD133）细胞代表EPCs，以此作标记用流式细胞仪测得正常人外周血中EPCs数量为500～1 000个/ml，但CHD病人的数目更低，由于数目较少，因而直接测外周血中EPCs数量误差较大。本文参阅国外有关文献[5]，在同等条件下培养外周血EPCs，对培养后的EPCs进行计数，以反映原先血液中的EPCs数量。EPCs经贴壁法培养纯化，再经过目前国内外通用的Dil-acLDL、FITC-UEA-Ⅰ荧光化学染色从功能上对EPCs进行标记后，双染色阳性细胞就基本上代表了EPCs的群体[6]。本研究发现，CHD病人外周血中EPCs数量较正常人明显降低，而服用辛伐他汀后，EPCs数量明显上升，且这种作用与其降脂作用无相关性，这提示辛伐他汀升高EPCs的作用不依赖于其调脂作用。体外实验发现，辛伐他汀可直接作用于EPCs，促进其增殖，这种作用可被PI3K/AKt信号转导通道抑制剂Wortmannin阻断。PI3K为生长因子受体超家族信号转导过程中的重要成员,可受多种细胞因子和理化因素激活，Akt是位于PI3K下游的一个重要激酶，二者均是促进细胞生存和维持细胞正常功能关键的信息分子，并且共同构成细胞对外应激反应过程中的促进细胞生长、抑制细胞凋亡和维持细胞重要功能的信号传递链。多种细胞的生存、凋亡信号通过激活PI3K/AKt信号途径进行传导。已有研究表明，他汀类药物是这一信号传导通路的激活剂。Wortmannin阻滞EPCs的增殖，提示辛伐他汀可能是通过这一信号转导通路起作用的。除了直接促进EPCs的增殖外，他汀类药物还能促进骨髓EPCs的动员与分化[7]，我们在以往的动物实验研究中也证实了这一点[8]，这也是应用辛伐他汀可以使外周血中EPCs上升的重要原因之一。总之，本研究发现，在体内和体外，应用辛伐他汀后都能促进EPCs的增殖，且这种作用与PI3K/Akt信号转导通路有关。
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