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发表于 2009-3-3 12:20 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：姚启盛,  叶章群,  陈丛波,  王小康,  王卫民,  陈立新作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科,湖北武汉  430000
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      【摘要】  目的：寻找一种最佳的骨骼肌干细胞分离及纯化方法。方法：采用成年雌性SD大鼠，分别采用二步消化法和Dispase消化法分离肌干细胞，然后用差速贴壁技术纯化肌干细胞，骨骼肌肌动蛋白（α-sarcometric actin）免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定。结果： Dipase组肌干细胞的数量明显多于二步消化法组，且细胞的生长速度也明显较后者快，而衰老速度则明显慢于后者。结论： Dipase可明显减轻细胞的损伤，提高肌干细胞的数量和质量，是一种最佳的细胞分离酶。 6 s. ~' a! y( N* w0 n4 ?  {
      【关键词】骨骼肌干细胞+ L/ f: c8 w) u0 {& E6 `
   The value of dipase in purifying skeletal muscle stem cellsYAO Qi-sheng, YE Zhang-qun,CHEN Cong-bo, et al.(1Department of Urology,Tongji Hospital, Tongji Medical College,Huazhong University of science and technology; 2Department of Urology, Taihe Hospital,Yunyang Medical College; 3Research Center of Molecular Biology, Taihe Hospital, Yunyang Medical College, Shiyan, Hubei 442000)# Z7 W4 R6 o: s5 R

Abstract: Objective To explore a best way of isolating and purifying skeletal muscle stem cells.Methods The mature female SD rat's muscle cells were isolated by two step enzyme digestion and dipase,respectively, cells were purified with preplate technique and identified by immunocytochemistry. Results Comparing with two step enzyme digestion group,The number of muscle cells and it's growth in the dispase group were obviously much more and rapid, respectively, while aging process became more slowly. Conclusion Dipase is a best cell isolation enzyme which can decrease cell injury and improve cell quantity and quality.

Key words: skeletal muscle stem cell; dispase; purify; culture; rat
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骨骼肌肌纤维膜外面有一种分裂能力很强的肌细胞叫肌源细胞（muscle derived cells, MDC），具有干细胞功能，可分化为骨骼肌纤维、平滑肌纤维、甚至软骨细胞。作为理想的供体细胞，肌源细胞自体或异体体注射，或者作为基因治疗的载体在心肌梗塞、压力性尿失禁、Duchenne氏肌营养不良（DMD）等疾病的治疗中受到广泛关注[1，2]。但成年动物的肌干细胞含量相对较少，加之体外培养时极易发生分化而停止分裂，给体外培养和大量扩增带来了困难，这直接影响其在各种疾病治疗中的应用。本研究采用Dispase消化法和其他常用的细胞分离方法分离骨骼肌细胞，差速贴壁技术纯化肌干细胞，发现前者大大减轻了对细胞的损伤，增加了肌干细胞的数量，为其在疾病治疗中的进一步应用打下了基础。  q7 p; n4 r6 x8 }) z
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1材料与方法

1.1主要试剂D’Hanks液；DMEM培养（Gibco公司）,Ⅰ型胶原酶，Hams F10培养基（Sigma公司）；Dispase (BD公司)；胎牛血清（杭州四季青公司）；马血清（Hyclone公司）；α-Sarcometric actin单克隆抗体、SABC试剂盒及DAB试剂盒购于武汉博士德公司。* e" N5 t9 B( K+ x) ~
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1.2骨骼肌细胞的分离选用成年雌性SD大鼠，体重250 g，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（50 mg/kg）。无菌条件下取前肢肱三头肌,尽可能剔除脂肪、肌腱等结缔组织，称重后用D’Hanks液冲洗两次,将肌组织剪成碎块(以不大于1 mm3为宜),移入离心管中，加D’Hanks液静置1 min，弃去上层液及漂浮组织。以后分两种方法分离细胞：①加入混合消化酶液（dispase 2.4 u/ml, collagenase 1%, CaCl22.5 mmol/l）,每克组织2 ml，37 ℃消化30~45 min，加入5倍体积的血清中止消化。反复吹打后滤过200目的筛网，收集滤液500 g离心7 min，弃上清液，细胞团块用生长培养基（含20%胎牛血清的Hams F10）重悬。②加入0.1%胶原酶37 ℃消化30 min，500 g离心1 min，去上层液；再加入0.25%胰蛋白酶37 ℃消化1 h（其间吹打数次）之后，加入5倍体积的血清中止消化。6 E1 w7 A% M& f3 X  i. q
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1.3肌干细胞的纯化、培养为减少成纤维细胞的污染，参照Qu氏[3]差速贴壁法进行细胞纯化，将细胞悬液置入经鼠尾胶原包被的培养瓶中培养1 h，贴壁的细胞为PP1；未贴壁的细胞悬液转入另一培养瓶中培养2 h，贴壁的细胞为PP2；未贴壁的细胞悬液再转入另一培养瓶中培养18 h，贴壁的细胞为PP3；未贴壁的细胞悬液转入另一培养瓶中培养24 h，贴壁的细胞为PP4。此过程重复（间隔24 h）至PP6。然后用生长培养基进行培养，4 d后换液，以后每天换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，待细胞生长至70%融合后传代培养。2 q& W# [: X: @/ ~: Z8 T0 O
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1.4细胞的鉴定取培养至第二代的细胞消化后以1105/孔接种于6孔培养板中,加入生长培养基进行培养,待细胞分裂、增殖至80%融合后，改用分化培养基（含2%马血清的DMEM）培养，待肌管形成后，行α-骨骼肌肌动蛋白（α-sarcometric actin）抗体免疫细胞化学染色行骨骼肌细胞鉴定。9 m9 S4 B: J7 D# _( u3 h5 ]  D! `
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2结果

　　方法1：倒置显微镜下观察，PP1、 PP2细胞贴壁迅速，细胞形态呈扁平、多突起，且胞浆极其丰富，细胞数量多，生长迅速。PP3以后的细胞数量逐渐减少，贴壁缓慢，早期细胞呈梭形或纺锤形（图1），随培养时间延长，单核细胞增殖呈细长梭形，相互融合并逐渐规律性地沿一个方向平行排列，并形成多核的肌管。经α-sarcometric actin免疫细胞化学染色，骨骼肌干细胞呈阳性（图2），而成纤维细胞和平滑肌细胞均为阴性(图3)。PP1、 PP2阳性率低，PP3~PP6阳性率逐渐增高，肌管为强阳性。方法2：PP1、 PP2及 PP3同方法1相似，PP4以后细胞明显减少，PP5和 PP6只有散在的几个细胞（图4），且PP5和 PP6细胞生长缓慢，很快衰老停止生长。其他同方法1没有明显差别。
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3讨论

　　在对DMD的研究过程中，对肌细胞的生物学有了进一步的了解。骨骼肌肌纤维膜外面有一种分裂能力很强的肌细胞称为MDC,具有干细胞功能，可分化为骨骼肌纤维、平滑肌纤维、甚至软骨细胞。作为理想的供体细胞，肌源细胞自体或异体体注射，或者作为基因治疗的载体在心肌梗塞、压力性尿失禁、DMD等疾病的治疗受到广泛关注。尤其是在DMD的治疗中应用最多[4]。虽然通过骨骼肌细胞移植可使DMD患者的肌肉收缩力获得暂时的增强，但是移植的肌细胞在宿主体内存活时间短，加上免疫等方面的因素，远期治疗效果差。Beauchamp等[5]研究发现骨骼肌细胞移植后有两个死亡高峰期，其中75%于移植后1 h死亡，另一高峰期为移植后8~12 h，仅有约1%的细胞存活，其他细胞全部死亡。这1%的肌细胞能快速分裂、增殖并与宿主肌纤维融合。作者认为存活的这一极少部分细胞为肌干细胞。Qu等[3]采用差速贴壁的方法，按细胞贴壁的快慢将细胞分为PP1~PP6，采用免疫组化测定支架蛋白以进行肌细胞活性鉴定。结果PP1~PP6支架蛋白阳性细胞分别为7%~78%。作者将这6组细胞分别行细胞移植发现5和6组细胞的成活率最高，认为PP5和 PP6的细胞主要是肌干细胞。目前多数研究采用二步消化法分离肌卫星细胞（干细胞），但都没有进行纯化[6]。本研究通过对这两种方法对比发现二步消化法PP5和PP6的细胞数量明显减少，且易衰老，说明二步消化法对肌干细胞有损害，使肌干细胞的数量及质量均受影响。Dipase是一种温和的细胞分离酶，可明显减轻对细胞的损伤，提高细胞的数量。另外，传统方法采用结蛋白（desmin）抗体进行骨骼肌细胞的鉴定，但平滑肌细胞也是成纤维样细胞，而且也含有结蛋白，以往的研究忽视了平滑肌细胞的污染，本研究成功地采用了骨骼肌肌动蛋白抗体对骨骼肌干细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞进行了鉴别。再者，以前均采用幼龄动物进行肌源细胞的研究，而选择幼体的肌源细胞进行细胞移植治疗就只能采用异体注射，这将不可避免地带来排斥反应，使治疗不能获得永久的效果。本研究建立了一种新的成年鼠骨骼肌干细胞分离技术，为肌干细胞将来的临床应用打下了基础。
      【参考文献】
[1]    Murry CE, Wiseman RW, Schwartz SM, et al. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis[J]. J Clin Invest,1996, 98:2 512-2 523.

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   [2]    Yiou R, Dreyfus P, Chopin DK, et al. Muscle precursor cell autografting in a murine model of urethral sphincter injury[J]. BJU International, 2002, 89: 298-302.

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   [3]    Qu Z， Balkir L， van Deutekom JCT，et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy[J]. J Cell Biol,1998,142:1 257-1 267.
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[4]    Mauro A. Satellite cells of skeletal muscle fibres[J]. J Biophys Biochem Cytol,1961,9:493-495.) K8 L( |; ^1 J8 J$ Q1 d  p- A

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   [5]    Beauchamp JR, Morgan JE, Pagel CN, et al. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source[J]. J Cell Biol,1999,144:1 113-1 122.
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[6]    邬  江，钟世镇，徐达传，等。肌组织工程的基础研究——卫星细胞培养及鉴定[J].中国临床解剖学杂志, 1999,17(4):351-352.

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