还是关于elisa，请教各位高手

duoduo777001

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! ~+ L3 L' s( J* w& R一直都在准备elisa实验，主要是测定兔子体内的p物质的量。因为教授没有买试剂盒，所以用到的试剂都是自己配制的。这些试剂应该没有什么问题，因为已经反复查过文献，而且别人也用这些试剂做成功过，只是他们做的是病毒方面的。
* O! E1 ]3 A2 L# H一下有几个问题想请教，盼解答！& q& J0 R* S& [5 a( q
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1.我们现在最大的问题是标准物的浓度没有办法确定。问过很多人，都说我们既然是测定p物质的量，可以直接购买p物质作为稀释后作为标准品。另外看了很多资料，说是标准品浓度要根据样品中所含有的待测物质的量来确定。因为试剂盒不同，所以说明书上准品的稀释弄得都是不一样的。但是有些说明书上说到了该试剂盒“检测范围”如：40pg/ml~800pg/ml。不知道这个数值是不是就可以理解成，用这个试剂盒测定的话，实验的样品里所含有的P物质的量应该在该范围之内。另外：因为我现在不知道样品的待测物的量，如果不在这个范围之内该怎么办？9 w8 r2 F. \$ w9 f2 g
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2.我们现在使用的夹心法，但是1、2抗都是来源于兔子的，和我们测定物质（也就是待测抗原）是同一宿主的，看到有的资料上说1、2抗应该来源于不同的宿主，但是买不到相关的2抗。也有的说用间接法测定，就不用考虑1、2抗不同的问题了，但是间接法一开始就要求用抗原包被，也就是待测物，不知道这个包被的浓度应该怎样确定呢，也可以说是应该怎么稀释呢？, |! F7 G/ L& J9 F2 K

( l( t* J3 @: p' \: u3、洗板的时候是不是一定要在纸上拍干，我们紧紧是将试剂吸出丢弃后，加入washing buffer后，再用枪头吸出，反复操作，感觉没有完全干净。但是一起实验的人说如果用力拍的话会把包被好的抗体给拍下来，我觉得很诧异，不知道是不是这样的！
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4、显色剂用的是OPD，做过的人跟我说不用等30min，只要2~5min就可以了，看到颜色变化了就可以加入中止液（1M H2SO4），不知道是不是这样呢？  B( E9 q9 e* s( i' Q
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问题有点多，盼各位能够耐心的看完，急求解答，谢谢！# T& c, A* `" X  T- G& ]

! S9 C0 z9 m" q' W5 ~  w6 |( H补充一句，我们是先给兔子注射了50nM的P物质后，再在不同的时间抽取兔耳背静脉的血液，当时就再抽血后半个小时以内离心分离了血清和血浆，所用的样品是血清。不知道标准品的浓度和注射的P物质的浓度有没有关系。

bunny19870512

1.有些说明书上说到了该试剂盒“检测范围”如：40pg/ml~800pg/ml。不知道这个数值是不是就可以理解成，用这个试剂盒测定的话，实验的样品里所含有的P物质的量应该在该范围之内。.
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这是说,他们的试剂盒敏感度在这个范围内,你的样品浓度可以超出这个范围,但是他检测不出来,造成酶联仪读数不准,这个时候可以稀释样品再继续按梯度测量
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$ K' v! M2 w8 P% W2 T2.间接法一开始就要求用抗原包被，也就是待测物，不知道这个包被的浓度应该怎样确定呢，也可以说是应该怎么稀释呢？
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用蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度后,我记得稀释到6~10微克/ml,如果检测结果不好,可以减小稀释倍数
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7 r& W' J( H& ?& K7 B3.洗板的时候是不是一定要在纸上拍干   2 |0 u2 R3 T2 K7 y+ L  {
通常我们做ELISA如果没有洗板机的话,就要人工操作将残液甩掉,再于少有粉末的卫生纸上排干,以纸上不再有大量液体为准.我们用的是维达经典蓝色卷纸$ Y7 W7 v% M0 \$ \2 L
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4.显色剂用的是OPD，做过的人跟我说不用等30min，只要2~5min就可以了，看到颜色变化了就可以加入中止液（1M H2SO4），不知道是不是这样呢？8 f! ~7 u$ g0 b
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这个要看你肉眼所见颜色的变化,如果你看见的颜色比较浅,那就让它多孵育一会,如果颜色较深(紫黑色或深蓝色,记不清了),应立即加入终止液,否则酶联仪读数不准.一般都是孵育15~20min就可以终止了.

duoduo777001

谢谢解答！- D% x# f, P% ~. }
还有一问，因为是测P物质，这里的标准品选用生物素P物质可以吗？

duoduo777001

回复 2# bunny19870512   y5 ~' f% C4 y6 R1 j
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; S0 o! ?. y. |5 L% Z/ @4 Z    可以用生物素P物质作为实验的标准品吗？

bunny19870512

如果有已知浓度的P物质,我觉得应该也是可以的,公司里可以直接买到?那你还自己做P物质干嘛?

hhchen418

有些说明书上说到了该试剂盒“检测范围”如：40pg/ml~800pg/ml。是指对该试剂盒的线性范围在“40pg/ml~800pg/ml”之间，你可以看说明书上提供的标准曲线图，上面横坐标上的浓度应该与“40pg/ml~800pg/ml”一致。具体实验样品浓度应该要自己测定，建议通过预实验大概估计一下需要稀释的倍数

hhchen418

2.我们现在使用的夹心法，但是1、2抗都是来源于兔子的，和我们测定物质（也就是待测抗原）是同一宿主的。* x) L: D& e. W% r. N
对于此，楼主可以想象一下，用兔子来源的抗体检测兔子体内的抗原会是什么结果？结果会是阴性结果也变成阳性！建议抗体取不是来源于兔子的抗体

hhchen418

3. 包被的浓度应该怎样确定呢，也可以说是应该怎么稀释呢？
4 U, A5 c; H0 J9 k! }包被浓度的确定要用方阵滴定法

hhchen418

4.洗板的时候是不是一定要在纸上拍干，我们紧紧是将试剂吸出丢弃后，加入washing buffer后，再用枪头吸出，反复操作，感觉没有完全干净。但是一起实验的人说如果用力拍的话会把包被好的抗体给拍下来，我觉得很诧异，不知道是不是这样的！"
( G9 t4 e2 E6 N/ k3 V' t      拍板不会把过夜包被的抗体拍下来，我的经验是：拍得越干净，背景越低，即非特异性吸附越低，结果越精确

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