成鼠SVZ区原代神经干细胞流式分选怎么做？

mumudan

本人最近在做成鼠神经干细胞的分离，分离后的细胞直接上流式分选，但是由于阳性细胞比例太低，每次分选出来的都是碎片，阴性细胞虽然也有碎片但是还能看见点细胞，阳性连细胞都看不到，也不知道什么原因，重复很多次都是如此。本想通过密度梯度离心（percoll,1500rpm,15min）去除碎片，但是离心后的细胞量减少的太多又无法上流式分选，请教各位有没有做过原代分选，传授下经验吧！

sfk06

在离心后，重悬时用的液体加点血清，可以防止细胞聚团，这样细胞的聚集体少了，单细胞的个数相对会增多写  可能有点用  以前流式时一个老师教的

mumudan

7 _% a+ u( j1 c; W$ g" s: I* b) g6 z
1 \: E- [3 e8 {6 M, F4 G) K
但是我从原代处理到最后培养时间貌似比较长，FBS会让神经细胞分化，这么几个小时会不会影响细胞状态呢？而且FBS加到PBS中重悬细胞对孵育抗体没有影响吗,以前没有做过流式所以不是很清楚？

sfk06

你既然分选完还要用 这就需要慎重了   以前我们只是测周期和蛋白 因为一次实验不能说明问题 要不再重做一次试试

iseeyou1210

我想问一下lz，用的marker是什么，能不能把你的protocol贡献一下。
& L, u  @7 N* j& ~; M  M谢谢！

iseeyou1210

回复 3# mumudan
  g) Q7 o7 L6 [0 |0 o
2 p. p1 J: ]3 n' ?: X9 k1 |6 X) m1 o" ~
  能不能用2%的BSA/1xpbs来代替FACS buffer(2% FCS/1XPBS)来resuspend细胞.

mumudan

我用的就是一般干细胞的maker,protocol都是从BD的网站找的，而且每次我都会根据取材改变，所以我到现在也没有标准的protocol，都还处在摸条件阶段，如果后期有好的结果我会把那次的protocol整理后贡献出来的，不好意思了！