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作者：侯宁程萱孙彦洵程竞杨晓
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5 k! n( A2 [, k 【关键词】 胚胎干细胞 : A* n# G ?4 u- T& h
【摘要】 目的 建立具有高效种系嵌合能力的小鼠胚胎干细胞（ES细胞）系。方法 收集129/ter小鼠3.5天的囊胚，用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，经过4～6天的培养，离散明显增殖的内细胞团（ICM），经2次亚克隆纯化后，获得稳定传代的胚胎干细胞系。对获得的胚胎干细胞系进行核型分析，选择XY型胚胎干细胞进行显微注射，对小鼠胚胎干细胞整合进生殖系的能力进行分析。结果 获得了4株（GLDD-1-4）能够稳定传代的小鼠胚胎干细胞系。4株细胞系的核型正常率均>70%，其中GLDD-1、GLDD-2为XY型。通过囊胚显微注射法，将GLDD-1、GLDD-2ES细胞注入C57BL/6J小鼠的囊胚中，得到棕色嵌合体小鼠。选择高嵌合度小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，获得了棕色子代小鼠。结论 建立的2株129/ter小鼠ES细胞系具有种系嵌合能力，可用于利用基因打靶技术研制突变体小鼠的研究。
C, M! B, P; t! B: W' V8 A3 q/ U关键词 胚胎干细胞 建系 显微注射
6 T% n" P9 Q' d; ~5 p; aEstablishment of a high germline competent
2 A8 j# s1 T' v- D, p- z! Zembryonic stem cell line GLDD-1from mouse129/ter strain; i; C/ M( ~" o+ p4 i
Hou Ning，Cheng Xuan，Sun Yanxun，et al.. g4 y5 c, y- D# l6 k
Genetic Laboratory of Development and Disease，Institute of Biotechnology，Beijing 100071.* P' N# o0 e/ Y1 M
【Abstract】 Objective To establish the embryonic stem（ES）cell lines which could integrate into germline.Methods The E3.5blastocysts from mouse129/ter strain were collected and cultured on the fibroblast cell feeder layers.After4-6days of culture，the obviously proliferated inner cell mass（ICM）was isolated and disaggregated for subsequent culture.Embryonic stem cell（ES）lines which could be passaged stably were subjected to karyotyping.ES cell lines with XY karyotyper were introduced into blastocysts to evaluate their potential of germline transmission.Reˉsults 4embryonic stem cell（ES）lines which could be passaged stably named GLDD-1to GLDD-4were obˉtained.Over70%these ES cells have normal karyotyper.Two ES cell lines with XY karyotype.GLDD-1and GLDD-2were introduced into C57BL/6J blastocysts by microinjection.Germline transmission offspring were obtained by breeding the high degrees chimeras with C57BL/6J mice.Conclusion These results indicated that both GLDD-1and GLDD-2ES cell lines were able to integrate into germline efficiently and could be used for generating mutant mice using gene targeting.
; k" R4 W: D) _3 Q3 C3 o* JKey words embryonic stem cell germline transmission microinjection$ H. L7 J$ U, a+ Q
1981年Evans和Martin分别独立地从正常的小鼠囊胚中分离了小鼠胚胎干细胞 ［1，2］ 。小鼠ES细胞具有在体外无限增殖的能力，通过长期的体外培养和遗传修饰，经显微注射引入受体囊胚的细胞可以分化为成体的各种组织，并整合入生殖系 ［3］ ，小鼠ES细胞的分离和应用是ES细胞技术发展过程中的里程碑。它与同源重组技术的结合使得在生物整体水平上定向改变和修饰哺乳动物的遗传物质成为可能。作为基因打靶过程中的关键环节，具有正常核型，并保证在被引入受体囊胚时保持其高效的形成功能性生殖细胞能力的ES细胞系的建立和培养成为所有工作的基础。为了获得处于传代早期的ES细胞以进行基因打靶研究，我们建立了129/ter小鼠胚胎干细胞系，并对其核型和嵌合能 力进行了检测，获得了具有正常二倍体XY核型并能进入种系的2株ES细胞系。, V4 A/ y' n7 n) }5 E" j
1 材料与方法 U, N* l# C& a5 p0 ~% @1 p
1.1 材料 129/ter小鼠由北京大学实验动物中心提供，昆明白鼠及C57B1/6J小鼠由军事医学科学院实验动物中心提供。特级胎牛血清、DMEM高糖培养基、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青-链霉素均购自Hyclone公司。β-巯基乙醇、丝裂霉素C购自Sigma公司。小鼠白血病抑制因子LIF购自Chemicon公司，35mm、100mm、150mm组织培养皿及四孔板购自Nunc公司。
9 d5 R; Z4 D" J1.2 滋养层细胞的培养和处理 解冻小鼠原代成纤维细胞至2个100mm平皿中，于滋养层细胞培养液（DMEM，15鸖，0.1mMβ-巯基乙醇，0.1mmol/L青-链霉素，0.1mmol/L L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸）、37℃、5%CO 2 培养3天后，用胰蛋白酶消化处理并转移到6个150mm组织培养皿培养，3天后，再转移到40个150mm组织培养皿中培养3～4天，直到细胞铺满皿底。用终浓度为10μg/ml的丝裂霉素C处理成纤维细胞，37℃培养2～3h。将含丝裂霉素C处理过的，已失去有丝分裂活性的成纤维细胞冻存，制备为成滋养层细胞 ［4］ 。
* j3 x7 W) S3 a/ l1.3 ES细胞集落的分离及扩增 从3.5天孕鼠子宫中收集囊胚及桑葚胚并培养于滋养层细胞上，培养基为滋养层培养基含LIF（1000U/ml），四孔板每孔培养1～2枚囊胚，培养4～6天后，将增殖明显的内细胞团（ICM）消化、离散、再接种至新的四孔板中，2次分离其中出现的ES细胞集落，传至35mm平皿中，记作0代 ［5］ 。3 x: d- [ W- P+ m
1.4 核型检查 将生长旺盛的ES细胞用秋水仙素（终浓度为0.02μg/ml）处理1h，常规空气干燥法制片，Giemsa染色15min ［5］ 。油镜下观察，分析50个细胞染色体，观察整倍体数目，计算出整倍体百分率，同时用图像分析仪进行染色体扫描，配对。: p4 A2 \: E* p Q
1.5 嵌合能力的鉴定 用显微注射法将ES细胞引入C57BL/6J小鼠囊胚中，选用昆明白小鼠为假孕母鼠，所得嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配，根据后代毛色判断种系嵌合能力。由于供体ES细胞和受体囊胚来自不同毛色的纯色小鼠，只要得到的小鼠是毛色嵌合体，即说明该鼠是具有ES细胞整合的嵌合体小鼠。来自ES细胞的个体为棕褐色，而来自C57BL/6J的个体为黑色。
' J$ {8 ?# |# ~( q1 ]2 Y2 结果* X m! G# W9 \9 m9 [
2.1 129/ter小鼠胚胎干细胞系的建立 收集小鼠E3.5的囊胚94枚，用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层培养4～6天后，内细胞团增殖明显的囊胚数为39个（图1A）。ICM经胰酶离散后继续培养，其中10株形成ES细胞样集落。经2次亚克隆纯化后，最终获得了4株能够稳定传代的ES细胞系（图1B）。这4个细胞集落至今传代至18代，将之分别命名为GLDD-1，GLDD-2，GLDD-3，GLDD-4（表1）。# B1 Y* O* D' N+ u; Z; d
图1 小鼠ES细胞系的建立略) H+ L1 [( b) S& O; }
表1 小鼠胚胎干细胞建系情况一览表 略9 Y' w" P# N$ {
2.2 小鼠胚胎干细胞的核型鉴定 4个细胞系在第10代时进行了核型检查。GLDD-1、GLDD-2为XY型（图2），10代时具有正常二倍体核型的细胞比率约为75%，GLDD-3、GLDD-4为XX型，10代时具有正常二倍体核型的细胞比率约为70%。( q7 g+ W( Z% j1 ]/ Q# \. _
图2 ES细胞的核型检查结果略 o5 n+ V; g# T8 l2 X+ O7 d- M% Z
2.3 小鼠胚胎干细胞的种系嵌合能力分析 小鼠胚胎干细胞GLDD-1、GLDD-2通过显微注射引入受体小鼠C57BL/6J囊胚中。GLDD-1细胞移植2只假孕鼠，生育4只仔鼠，其中2只为棕色小鼠，雌、雄各一只，其余2只均为嵌合体小鼠。GLDD-2细胞移植2只假孕鼠，生育15只仔鼠。其中1只为棕色小鼠，为雄性（图3），其余10只嵌合度均在50%以上。将所获得的棕色小鼠与C57B1/6J小鼠进行杂交，观察种系嵌合情况，判断方法见“材料与方法”。来自GLDD-1的嵌合体中，棕色小鼠的种系嵌合率达75%，来自GLDD-2的嵌合体中，棕色小鼠的种系嵌合率达34%（表2）。' `* ~& r" J+ K: f( u3 p1 o
表2 GLDD-1、GLDD-2ES细胞种系嵌合体鉴定结果略: Z: n: b3 X1 d( L) O: K
图3 GLDD-2嵌合体的获得略
( ?# A; X; _/ X: p* O4 {3 讨论
( Z- H3 s% ^' ~4 \$ h0 d2 o小鼠胚胎干细胞（ES细胞）来自于受精后3.5天囊胚的内细胞团（ICM） ［1，2］。在囊胚贴壁后，分离ICM的时机十分重要，以ICM柱状生长时离散最为恰当。早期分离则形成ES细胞的数目太少，而稍后分离可能会对ES细胞的全能性受到影响。我们选择5～7天时进行ICM离散。离散时尽量减少对ICM的损伤，我们采用200μl加样枪将ICM吸出，再进行消化重新接种，而在ES细胞亚克隆的分离时，我们采用口控管进行离散，这样对滋养层细胞以及周围的ES细胞克隆影响较小，最大程度地将所有的ES细胞离散，进行二次接种。$ a; k6 {: A* j9 x
由于ES细胞是一种正常的胚胎干细胞，因此要求它具有正常的二倍体核型，核型不正常的细胞很难进入种系。研究中发现，XY型的细胞较XX型的ES细胞更容易形成种系嵌合体 ［5］ 。因此，早期的核型检查有助于尽早了解所得到的ES细胞系的使用价值。ES细胞在培养过程中，会出现少数细胞分化的现象，可采用提高滋养层密度或加大的LIF含量，可有效地得到控制。另外，ES细胞培养易受外界因素影响，对去垢剂十分敏感，故培养需使用一次性细胞培养耗材。- n8 H- B2 A. f2 d3 h
国内对ES细胞技术的研究从80年代后期开始，北京大学尚克刚等自1987年开始ES细胞的建系和研究工作， 较成功地分离出不同小鼠品系的ES细胞系，并于1999年首次获得可进入种系的ES细胞系 ［6，7］ 。但国内未有用于基因打靶的ES细胞系的报道。本实验室于1999 |
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发表于 2009-3-3 12:21
发表于 2015-5-22 15:18
