心外膜祖细胞的命运：来自不同的声音

zhangjinxy

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加州大学的蔡晨冷（Chen-Leng Cai）等人08年在Nature杂志发表了题为A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells的文章，主要解析了心肌细胞的祖细胞来源，经过研究蔡等人认为室间隔，心房和心室壁的肌细胞来自表达Tbx18的心外膜细胞系。而来自荷兰的研究者认为，Tbx18本来就在心肌层细胞中自我表达，以Tbx18为证据证实肌细胞来自心外膜细胞系是不科学的。面对质疑，蔡等人回应，用两种不同的方式交叉证实他们的观点，证实心外膜细胞系就是发育成心肌细胞的祖细胞。
9 S+ O: C8 j0 ?3 ~7 s) R$ n0 |5 M质疑：Tbx18与心外膜祖细胞的命运（NATURE| Vol 458| 16 April 2009）& G" @8 t) B1 `' C; i, T- f) ~
   该文源自：C.-L. Cai et al. Nature 454, 104–108 (2008)
# G* }1 Q' j! B- w揭示心肌细胞的来源对理解和治疗心脏疾病至关重要，蔡等人的研究提示，表达Tbx18的心外膜细胞系为形成室间隔、心房、心室壁发挥了重要作用。我们的研究显示，T盒转录因子基因18（Tbx18)本身就在心肌细胞表达，同时显示，在活体上，根据他们的遗传连锁示踪系统并不能得出心肌细胞来源于心外膜细胞系的结论。
" T2 v; w5 M1 g/ ~) p" [2 u, P在脊椎动物胚胎形成时期，所有细胞均来源于心外膜前体细胞，间皮细胞群集在心脏的静脉极，随后肌层迁移形成心外膜，最终形成了心脏内层的上皮细胞层。鸡的连锁分析提示，心外膜细胞嵌入心肌细胞，形成冠脉血管支持细胞和外层成纤维细胞。
. j  l5 R/ f& ?( P 在小鼠，基因连锁分析常用来评价前体细胞对成熟组织或器官的贡献，蔡晨冷（Chen-Leng Cai）等人在心外膜前体细胞或心外膜细胞方面所取得的研究成果是建立在T盒转录因子基因18在胚胎组织高水平表达基础上的。用CRE重组酶敲入Tbx18位点，心外膜细胞就被不可逆标记且它们的子代在发育过程中就可以被随访，作者发现，除了已知的作用外，Tbx18阳性的心外膜细胞有助于形成室间隔、心室壁，很明显，这个发现将把心外膜细胞作为以前未知的心肌细胞祖细胞池，作为心脏早期发育第一第二阶段的补充。
" u; M# o1 D4 i- a   任何基因连锁分析必然要研究驱动CRE重组酶的基因特异性，在这个特别的例子，Tbx18不应该在心肌细胞表达，我们以前的研究观察到，在胚胎时期12.5天，T bx18在室间隔、心室壁表达。更多的分析提示胚胎时期10.5-16.5天T bx18在室间隔、心室壁持续表达。T bx18和Tnmi3在相邻心肌共表达，用抗T bx18抗体做免疫荧光分析证实胚胎期10.5天以后T bx18蛋白就在Nkx2-5阳性的室间隔、心室壁持续表达。在胚胎11.5天的野生型心脏外膜以外的室间隔组织用激光捕捉显微解剖法检测前信使RNA，证实了Tbx18在心肌细胞最初就表达。蛋白激酶C（Prkci）无效突变体不能在心室周围形成心外膜，并在胚胎12，5天死亡，T bx18在室间隔的表达模式跟对照组相似，更多的研究显示，T bx18在室间隔、心室壁的表达是独立于心外膜的。
; T! P1 y4 J5 W# E3 g, _9 M) s6 o我们把CRE重组酶基因敲入T bx18的等位基因，CRE重组酶的激活模式能忠实的反映内源性T bx18的表达水平，根据野生型等位基因、lacZ、 R26RlacZ报告基因比较相邻心脏部分T bx18的表达水平，R26RlacZ胚胎显示出与CRE重组酶模式有部分重叠，内源性T bx18在室间隔、心室壁表达。而且，我们观察到在Wt1基因突变小鼠，来源于T bx18CRE等位基因的CRE重组酶活性在室间隔、心室壁没有变化，在这些小鼠，心外膜和心外膜下间质严重缺乏，再次提示，T bx18的表达在存在形式和功能上是独立于心外膜的。总之，我们的结果清楚的显示，T bx18的表达在胚胎10.5天就存在于室间隔、心室壁。
7 m# X0 {7 a/ p  q4 ?8 S蔡等人的研究不能在心肌细胞中检测到T bx18的表达也许是由于缺乏敏感的检测方法和工具，他们的T bx18CRE等位基因有可能在心肌细胞被激活，这跟我们的相似，也许能够在心肌细胞中激活，但是它的表达模式也许会被磷酸甘油酸酯激酶neo盒影响，因而导致了在心脏CRE的异位激活。基因连锁分析也跟蔡等人的相似，表达Wt1CRE的心外膜细胞的命运也提示心外膜细胞不同于为心肌细胞。因此我们分析，蔡等人的基因连锁分析并不能清楚的提示，在活体上心肌细胞来源于心外膜细胞系，T bx18独立于心外膜的观点需要进一步评价特殊祖细胞向特殊细胞分化的关系。+ u5 x, j0 \- S! D
蔡等人的回应：Cai et al. reply8 }0 h+ K( H% x; r
我们认识到用两种方法从Cre连锁分析获得可靠数据的重要性，因此用了荧光染料来连锁标记心外膜细胞。该方法证实了在心脏心外膜细胞对形成心肌细胞有重要作用。我们的实验中并没有观察到在胚胎10.5天至11，5天的心室肌细胞中有T bx18RNA的表达。然而，我们观察到，这阶段在心外膜细胞RNA强烈表达，这和Christoffels 等人观察到的一样。我们注意到了RNA和和蛋白质的染色数量在我们的试验和Christoffels 等人的试验有差异。造成这种差异的原因还不清楚。Christoffels 等人用逆转录聚合酶链式反应技术检测胚胎11，5天时室间隔中T bx18的基因序列，但没提供成熟Tbx18mRNA的相关数据。值得提出的是，我们在胚胎11，5天的非心肌细胞中观察到了Tbx18的表达。% }. ]; A! K9 _, x& C$ R( q
    在我们的试验中尽管染色过度，但Tbx18:nlacZ的表达和RNA的一致，我们检测了多个心脏的多个切面，观察了T bx18CRE连锁跟踪的心肌细胞，发现Tbx18:nlacZ在胚胎10.5天至11，5天的心脏中没有表达。β半乳糖苷酶的免疫荧光染色和X半乳糖得到的数据一致。为什么我们的数据和Christoffels 等人不一致，可能是Tbx18免疫荧光染色的数据不清楚，Christoffels 等人用Tbx18抗体染色心脏，结果显示Tbx18的阳性染色水平心脏内比心外膜的低，Prkci-/-突变体的数据很难去评价，因为这种模式在文献中没有描述过。发表的文章中，Prkci-/-突变体不能生存到胚胎期9.5天以后。在胚胎期12.5天我们也观察到了Tbx18:nlacZ在心脏的表达，但发现表达的细胞不是心肌细胞，Christoffels 等人并没有阐述Prkci-/-突变体的细胞类型。
8 r- S: T2 U: u5 [. O   在Wt1突变体中对Tbx18进行连锁分析时，应当考虑到Wt1突变体表型多样性及其压力背景的重要性，突变体可能在胚胎12，5天死亡或者在整个妊娠期存活下来，甚至在C57/BL6近交系，致死率有一个较宽的时间窗（胚胎12.5-15天），甚至在一些影响严重的个体，心外膜都在绝大部分的心脏部位存在，包括相邻间隔和左室的尾部区域，在心室内及室间沟也观察到了心外膜细胞进入心脏。Christoffels 等人在Wt1突变体的数据显示，有大量的心外膜细胞出现，特别是在室间隔区域，与大部分连锁跟踪的细胞相邻。部分区域无心外膜细胞，反映了这些区域最初就无心外膜细胞，或者以前曾持续存在的心外膜细胞向内迁移了。根据以前的观察，还不知道在这些Wt1突变体有多少发生了迁移，因此很难在这个研究中做出结论。+ b$ M; J3 C  l- h9 U% B: M
    我们认为所有的证据一致提示，Tbx18的心外膜细胞系有助于形成心肌细胞，荧光染色连锁分析心外膜细胞以及周等人的可诱导的Wt1CED研究也提示，心外膜细胞系在形成心肌细胞中起重要作用。

xuhuanyu

不同的声音
& m9 f% ^* g6 R$ o* I有无定论？# J$ O# C$ X7 s
出现问题的的原因，各执一词啊