一个奇怪的PCR设置，请教一下前辈

张也行

我们要扩单细胞的整个cDNA，为了获得足够的产物最后需要进行PCR扩增，文献上的PCR程序是20个循环，每一个循环延伸时间要增加6s，说目的是减少非特异性产物。感到很奇怪，哪种PCR仪上有时间梯度啊？该怎么设置呢？总不能守在PCR仪旁边每个循环每个循环的设置啊！哪位前辈有什么妙招没有？哈哈

spiritneil

3 B$ b, `; P, N4 a# c6 T

4 N% n+ H$ i  n7 c3 a3 Q啥意思？第一个循环x秒，第二个循环x+6秒这样？查了下是为了减少扩增进程中不断降低活性的Taq聚合酶所造成的误差？如果非要这样就单独设个专用的程序存着吧.20次而已@@能和电脑联机的pcr仪都可以在电脑上设置吧应该要方便点。或者是有专门的可以编程的梯度PCR基因扩增仪。

张也行

哈哈 你说的东西都好先进啊，我都没听说过。普通PCR设置的设置的时候好像就有一步是连接到外部电脑的，不过没用过啊，也不知道用电脑怎么设置啊？

hndxws

这个PCR程序有问题，这种程序怎么能减少非特异性产物呢？不太可能减少吧

healthlicn

每次延伸增加六秒是为了使扩增产物延伸完全，因为随着循环增加，反应体系中的模板量增加而各种反应底物的浓度降低有可能会造成扩增不全，在电泳时出现拖带。
# t8 r. _) U( c* m, \7 c( b普通PCR仪就具有自动增加延伸功能，怎么设置建议你咨询师兄师姐。

张也行

回复 4# hndxws
5 r$ M+ ?+ Y& c
# U1 }/ S8 C( Y$ ^  Z6 N0 ]+ }感觉这么设置也有些道理：
# |: k; C* a0 i1 G1.就像healthlicn说的“因为随着循环增加，反应体系中的模板量增加而各种反应底物的浓度降低有可能会造成扩增不全” 从而增加非特异性扩增，我们后面要Realtime PCR检测一些基因的表达，所以可能会影响实验结果；
( Z( L- f$ v) l6 j9 d  m; _  G# d5 c# y1 s- o
2. 随着PCR的过程，酶的活性以及反应物浓度下降，可能会产生副产物。

weiyepan

一般现在的PCR仪都有每一步增减时间或者温度的设置，具体要看说明书。  m/ O7 r: [; {; u% Z  F
就是每进入到下一个循环的时候按照设置增加或者减少时间或者温度。
& L) U! \" j3 x例如我们实验室现在用的TAKARA的就有，以前最早的ABI的也有。
  m: F! r0 O" v# m7 c+ [但是，增加延伸时间并不能增加特异性，一般是增加退火温度。

张也行

回复 7# weiyepan 6 r8 {1 R& i% U; L

# t% k9 F' d( \1 F' f+ r哦 我们的好像没有啊  / J' i2 ~, v8 c  H& K
    我们的都是普通的，呵呵

weiyepan

好像国产的就很少有，进口牌子的这是标准配置。我们现在都买takara的，便宜，质量一般ok。; O: x: M, W. N' R1 m6 L
而上面所说的保证延伸时间，其实可以一开始就设定较长的时间，效果没什么不一样，不知道为什么要用渐升。不过文章里面的东西不是全对的，不要盲信。

上海过客

EPPDENORF   的  都有