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作者：房佰俊，宋永平，曹莹，林全德，买玲作者单位：河南省肿瘤医院、河南省血液病研究所，河南郑州 450008；河南大学医学院，河南开封 475200 6 Q: u2 d% O& Q+ a1 q6 `
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% ]0 v- T) D( a. C 【摘要】 目的 体外定向诱导成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞分化。方法 首先将成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞培养在含适当浓度的B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)的培养基中诱导，接着更换诱导培养基，用含适当浓度的β细胞调节素、尼克酰胺等高糖无血清培养基诱导细胞向胰岛样细胞分化。用RTPCR法检测诱导前后nestin、ngn3、胰岛素启动子因子1(IPF1)、胰岛素及胰高血糖素基因的表达；免疫荧光染色法检测诱导前后nestin、胰岛素及胰高血糖素的表达；放射免疫分析法检测诱导前后细胞分泌胰岛素情况。结果 成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞经第一阶段的诱导后可分化成nestin 阳性的祖细胞，继续诱导6d后变圆的细胞逐渐增多，并最终聚集成团。免疫荧光实验证明经诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等内分泌激素；放免分析结果表明，诱导的胰岛样细胞团可以分泌胰岛素。结论 成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞具有胰腺干祖细胞的固有特征，极有可能作为种子细胞用糖尿病的细胞治疗。
* d- z9 O6 [" `2 u/ T 【关键词】干细胞；胰岛；脂肪
+ d# [1 Z- j+ v# Z( K- p) M% }" f 糖尿病是严重危害人类健康的常见多发病，目前临床对Ⅰ型糖尿病所用的胰岛素注射疗法并不能令人满意。 近几年，经肝内门静脉植入胰岛细胞治疗糖尿病取得了一些疗效 [1]，但遗憾的是，胰岛细胞移植仍面临诸多难题，如供者来源不足及严重的免疫排斥反应等。 因此，积极寻找新的胰岛细胞资源已成为当务之急。胚胎干细胞具有发育的全能性，可自发分化或经诱导分化为胰岛细胞[23]。另外，有学者[4]对胰管上皮细胞及胰岛细胞进行培养，诱导nestin阳性的胰腺干细胞分化为内分泌腺细胞。可见，胚胎干细胞和胰腺干细胞均可成为糖尿病细胞治疗的种子细胞。但是，它们又存在伦理学上的争论及取材不便等问题，从而限制了临床运用。我们前期的研究结果提示，成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞几乎具有类似于胚胎干细胞的全能性[5]。因此，在本实验中，我们探索了诱导成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞分化的条件，以为用细胞治疗糖尿病提供合适的种子细胞。. a, }$ C. J: V/ l, q
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1材料与方法
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1.1成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞的分离和培养[5]
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抽取适量皮下脂肪组织，剪碎，用DHanks液洗去血细胞，20mg/L Ⅱ型胶原酶消化2h，洗掉胶原酶，用FicollPaque(1.077mg/L)分离液分离得到单个核细胞后，用CD45及GlyA磁珠(德国Miltenyi Biotec公司)分选去除CD45 及GlyA 细胞，将阴性选择所得细胞接种在96孔细胞培养板中(每孔1个细胞)。96孔板预先以ECM胶[含5g/L骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein4, BMP4，美国Sigma公司)， 30μg/L干细胞因子(stem cell factor，SCF，美国Sigma公司)及3%(体积分数)胎牛血清(英国Gibco公司)]铺板。20d后，挑取单克隆细胞，扩增备用。扩增培养液成分为：40%(体积分数) MCDB(英国Gibco公司)，56%(体积分数)DF12(英国Gibco公司)，4%(体积分数)胎牛血清(英国Gibco公司)，20μg/L 白细胞介素6(interleukin6，IL6，美国Sigma公司)。
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2 h6 Y5 r7 U2 D' A7 e2 V' f, G; f 1.2体外诱导成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞团分化
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" W! `* u. h( S: T5 @: q* { 取成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞以2105/mL密度接种于6孔板中，每孔加3mL诱导液1[含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，美国PeproTech公司)，10μg/L表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF，美国PeproTech公司)及0.2g/LB27的IMDM(英国Gibco公司)培养液]，经诱导液1培养6d后，去除旧培养液，用PBS缓冲液洗细胞，添加诱导液2[含10μg/L β细胞调节素，10μg/L肝细胞生长因子(美国R&D Systems Inc公司)，10μg/L活化素(Activin A，美国R＆D Systems公司)和10 mmoL/L尼克酰胺(美国Sigma公司)及0.2g/L B27的IMDM培养液]，继续培养6d。
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( P( _( O- X! z+ [1 J4 q Y& J 1.3RTPCR鉴定基因的表达- N `/ s( o# W+ S( W% P, T
$ i% V5 G2 @* w# ?, G 用Trizol试剂(Gibco)提取成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞及诱导6d或12d后细胞的总RNA,反转录合成cDNA，用PCR鉴定nestin、ngn3(neurogenin3)、胰岛素启动子因子1(insulin promoter factor1，IPF1)、胰岛素、胰高血糖素的表达情况。所用引物序列见表1。表1胰岛素、胰高血糖素、nestin、ngn3、IPF1等基因的引物序列（略）
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1.4免疫荧光鉴定抗原的表达3 k0 g9 B$ N' s
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将诱导6d的细胞制成爬片，诱导12d的细胞团制成石蜡切片，细胞爬片经常规方法固定脱水后，参照HistostainTMSP(链酶卵白素过氧化物酶)试剂盒(美国Santa Cruz 公司)操作方法进行免疫组织化学染色。抗人nestin抗体、抗人胰岛素抗体、抗人胰高血糖素抗体、抗人生长抑素抗体均为美国Santa Cruz 公司产品。% `# x3 Q+ ^2 r( Q
& o F/ N" q( T* P 1.5放射免疫分析法检测胰岛素水平
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挑取诱导12d的细胞团用KRBB缓冲液洗两遍后，置于24孔板中，分3孔，每孔约90-100个细胞团，直径约150μm，各孔加入1mL含5.6mmol/L葡萄糖的KRBB缓冲液，置37℃孵箱中孵育1h，弃掉旧缓冲液，以含5.6mmol/L葡萄糖、16.7mmol/L葡萄糖的KRBB缓冲液依次孵育1h ，收集上清，收集各孔的细胞团，加入酸乙醇溶液，4℃过夜，用细胞超声破碎仪破细胞，上清保存于-20℃。用放射免疫分析法(试剂盒购自海军总医院)检测各上清中的胰岛素含量，用BCA(bicinchoninic acid)测定法检测细胞内总蛋白含量。
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2结 果
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5 m, q0 j3 S7 x: \ 2.1诱导Flk1 CD31-CD34-细胞分化过程中的形态变化1 B+ A) f8 e9 l; L+ P% L, X
+ r8 y4 Z8 @, C; u2 c 与对照组细胞相比(图1A)，用诱导液1培养Flk1 CD31-CD34-细胞的过程中，细胞形态略有变化，多呈长梭形，折光性有所增强；诱导6d后换用诱导液2，到8d，变圆的细胞明显增多、聚集成团(图1B)，12d时多数细胞已经聚集成团(图1C)，半悬浮于塑料培养皿中，类似于胰岛。7 C x8 @: w8 l0 E$ I
i ?0 T7 b7 D9 J" {! I- {) }6 c% ` 2.2RTPCR鉴定结果
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; t2 y) f% n9 m8 I' E2 f nestin、ngn3基因的表达情况：未诱导的细胞不表达nestin及ngn3，经培养液1诱导3、6d时检测到了它们的表达；换用培养液2继续诱导后，nestin及ngn3基因的表达逐渐减弱，12d时有微弱表达或完全消失(图2)；未诱导的Flk1 CD31-CD34-细胞不表达IPF1、胰岛素(insulin)、胰高血糖素(glucagon)，经培养液1诱导6d检测到3个基因的表达(图2)。0 ^, H0 V4 R8 t1 W$ p# g
' e0 c) o6 O# U8 u6 o 2.3免疫组化染色结果+ y/ `! k5 D2 x2 Y4 L
' r+ w( E( @$ L5 }8 {" H 在Flk1 CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞团诱导分化的第一阶段，nestin蛋白的表达逐渐达到高峰(图3)；在第二阶段诱导过程中，nestin蛋白表达逐渐减少，经诱导液2培养6d后已检测不到nestin蛋白的表达；未诱导的细胞无胰岛素、胰高血糖素及生长抑素抗原的表达，而在经诱导液2培养6d后的细胞胞内可检测到这3种内分泌激素的表达(图4)；双色免疫荧光染色结果提示部分细胞同时表达胰岛素及胰高血糖素(图4)。
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2.4胰岛样细胞团胰岛素分泌的测定# q! S! x$ F% R2 T+ ~9 G
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Flk1 CD31-CD34-细胞的培养上清中几乎检测不到胰岛素，而经第一阶段诱导后的细胞逐渐向胞外分泌胰岛素，经诱导液2继续培养6d的胰岛样细胞团，在5.6mmol/L葡萄糖下向胞外分泌的胰岛素为(31.19±3.38)u/mL，胞内胰岛素含量为(60.37±8.89)μg/g蛋白。
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胰岛主要是由α、β、δ、pp 4种细胞组成，由单一的成体干细胞分化为含有多种细胞成分的细胞团，其微环境尤为重要。我们根据胰腺与神经系统发育的相似性，首先用EGF、bFGF诱导成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞向nestin阳性的祖细胞分化。Zulewshi等[6]证明了人及大鼠的胰管及胰岛组织存在胰腺干细胞，这些干细胞表达nestin这一神经干细胞的特征性标志。我们通过RTPCR法验证了诱导初期的细胞表达nestin，而ngn3、IPF1的表达则进一步证明了诱导早期的细胞具有胰腺干祖细胞的特征。接下来，经过筛选，我们选用无血清的高糖培养基,补充神经培养液添加剂B27，尼克酰胺及betacellulin、activin A、HGF等细胞因子，为nestin阳性的胰腺干细胞向胰岛细胞诱导分化构建适宜的微环境。尼克酰胺能够促进胎胰细胞分化并增加β细胞的数量，Activin A与betacellulin等因子组合可以促进β细胞分化。NIP经此培养液诱导后形态变化很大，细胞由梭形逐渐变圆,并逐渐聚集成团，很象胰岛。nestin及ngn3在诱导后期表达量逐渐减低与分化的胰岛细胞逐渐关闭这些基因的表达相一致。ngn3只表达于胰岛前体细胞中,它是决定4种胰岛细胞分化的关键性因子[78]。IPF1是胰腺发育过程中一个重要的调控元件,也是胰岛素基因的转录激活子。从免疫荧光染色结果来看,很多细胞同时表达胰岛素、胰高血糖素等内分泌激素,表明体外诱导产生的胰岛样细胞团并未完全分化成熟,在胰腺发育早期胰岛中很多细胞也同时表达这两种激素。诱导产生的胰岛样细胞团分泌的胰岛素量较低,糖反应性较弱,可能与诱导的细胞未完全分化成熟及诱导培养体系不完善有关。总之，成人脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞在一定条件下可以被定向诱导分化成胰岛样细胞团，从而可能为实现糖尿病患者用自体干细胞治疗自身疾病开辟了一条新的途径。
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