异基因造血干细胞移植后受者骨髓的间充质干细胞来源研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:22 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：王婧，刘开彦，陆道培作者单位：北京大学人民医院，血液病研究所，北京 100044 % ~! j, ?+ `! L& r0 Y

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      【摘要】  为了研究造血干细胞移植植活患者骨髓源间充质干细胞（MSC）的来源，选择临床上供受者性别不同的造血干细胞移植后临床植活的34例患者作为研究对象，抽取骨髓，进行间充质干细胞培养传代，利用流式细胞术 (FCM) 检测患者MSC的表面抗原表达特征，利用聚合酶链反应 (PCR) 分析患者MSC的釉基质基因表达情况以确定其性别来源，利用荧光原位杂交 (FISH) 技术进一步证实患者MSC的性别来源。结果表明：34例患者中有31例患者的MSC原代培养能达到融合，其中24例患者成功传代5代以上，且可进行PCR及FISH检测；FCM结果显示，第5代MSC的CD14 CD45 细胞表达低于0.04%；PCR结果显示，移植后患者的MSC源于患者本人；FISH结果显示，移植后患者的MSC 100%源于患者本人。结论：造血干细胞移植后患者骨髓中的MSC仍源于患者本人。 $ F! ^! Y# _/ ~+ f0 ?
      【关键词】造血干细胞移植
   　　Origin of Mesenchymal Stem Cells inBone Marrow of Patients after Allogeneic Stem Cell Transplantation4 g% m6 f$ x8 r) z% ^- g) ]
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　　WANG Jing，LIU Kai-Yan，LU Dao-Pei4 i; i4 F3 F: L1 e2 f
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　　People′ s Hospital，Institute of Hematology，Peking University，Beijing 100044，China

　　AbstractThe aim of this study was to investigate the origin of bone marrow-derived mesenchymal cells in 34 patients who had received a sex-mismatched hematopoietic stem cells transplant (HSCT).The mesenchymal stem cells (MSC) from 34 patients were collected fortest.The different passage MSC of patients were analyzed by flow cytometry (FCM) to reveal the cell surface antigen expression.The polymerase chain reaction (PCR) analysis of the amelogenin (AMEL) genes was used to detect donorcellsfrom host cells.The cultured MSC were stained by fluorescence in situ hybridization (FISH) probes for chromosomes X (Xp11.1-Xq11.1) and Y (Yq12) to distinguish donor cellsfrom host cells.The results indicated that 31out of34 cases showedthe confluent stroma and 24 out of these31 cases were successfullypassaged for more than 5 generations which could be used for PCR and FISH analysis.According toFCM resultsthe number of CD14 CD45  cells，which wasregarded as monocyte/macrophage from the cultured MSC (passage 5) was less than 0.04%.In PCR assay，the marrow-derived MSC from thepassage 5 were found to be of host origin. FISH assay demonstrated thatmarrow-derived MSC from thepassage 5 were found to be of host origin up to 100%.It is concluded that the origin of MSCin bone marrow of patients after allogeneic stem cell transplantation was confirmed to bederived still fromthe recipients their own.8 i" f. A& y. Q! a; U; Q9 d' u
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　　Key wordshemotopoietic stem cell transplantation;allogeneic hemotopoietic stem cell transplantation;mesenchymal stem cells

　　源于人骨髓的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC），占骨髓中有核细胞的0.01%-0.001%。从骨髓中分离出的MSC能在体外大量扩增且具有自我更新的能力［1］。MSC能产生多种细胞因子、化学因子及细胞外基质蛋白，在造血细胞的生长、成熟、归巢及增殖中均具有重要的作用［2-5］。在异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)临床植活的患者中MSC是否为供者植活一直存有争议［6-11］，目前对SCT后患者MSC的来源问题尚无定论。本研究选择临床上供受者性别不同的allo-HSCT后临床造血植活的34例患者作为研究对象，对allo-HSCT
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　　后造血植活患者中骨髓源的MSC的植活来源，进行了研究。4 \# J; r; _/ f; ?
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　　材料和方法
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　　病例
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　　病例来自北京大学人民医院或北京道培医院，为供受者性别不同、造血植活的allo-HSCT患者共34例，其中男性17例，女性17例，年龄介于16至48岁之间。预处理包括马利兰（busulfan，Bu）/环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）或Bu/CTX加抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）。造血干细胞来源为：骨髓移植者3例，动员的外周血干细胞移植者2例，骨髓加动员的外周血干细胞移植者19例，骨髓加动员的外周血干细胞再加第三者脐血混合移植者10例。移植后给予的免疫抑制剂：氨甲喋呤（methotrexate，MTX），霉酚酸酯（mycofenolate mofitile，MMF）及强的松等。利用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)分型及短串联重复序列聚合酶链反应（short tandem repeat-polymerase chain reaction，STR-PCR）等方法进行造血植活及嵌合分析（附表）。Table.Characteristics of34 patientsreceived HSCT（略）! U, o! u+ C  K
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　　MSC的分离及纯化

　　对患者及供者行髂后上棘穿刺抽取骨髓血10 ml，骨髓用PBS (0.01 mol/L，pH 7.4)1∶1稀释后，Percoll（比重1.073 g/ml）900g梯度离心30分钟，离心后收获分离的单个核细胞，用DMEM-LG洗2次，以1.4105 /cm2的细胞密度接种于T-25培养瓶中，培养基DMEM-LG（Gibco BRL life Technologies，USA）含10鸖，在37℃，5% CO 2条件下孵育。每3天全量换液，待细胞长至85%至90%融合时，用0.25%胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA (Gibco BRL life Technologies，USA) 37℃条件下消化3-5分钟，以1.3104/cm2的密度在T-75瓶中进行传代培养。每次传代均更换新培养瓶。) w  g8 f# d0 s2 }

　　流式细胞术(flow cytometry，FCM)分析" b" F7 c1 y3 z2 ?

　　不同代数MSC用0.25%胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA消化，配制成1106/ml的细胞浓度，与CD14-PE，CD45Per-CP，CD44-FITC，CD29-APC(BD Biosciences，USA)避光孵育15分钟，用PBS（含2%血清白蛋白）洗涤2次后，以PBS悬浮或1%多聚甲醛固定待上机。对照采用IgG1-PE，CD45-Per-CP，IgG2b-FITC，IgG-APC。每次上机( FACSBD Biosciences，USA)分析10 000个细胞，使用CellQuest 软件 (BD Biosciences，USA)进行数据分析。4 w: w1 N5 [% w6 {6 g
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　　釉基质基因分析* M! U8 r# s( Z1 ]+ q8 r+ \4 H
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　　通过单步PCR反应扩增釉基质基因（amelogenin，AMEL）可同时分辨男性或女性细胞来源［12］，电泳后女性细胞形成单条977 bp的条带(AMGX)，而男性细胞形成2条977 bp (AMGX)及788bp (AMGY)的条带，第5代患者MSC悬浮于PBS中，使用DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek，Inc.)进行DNA抽提。每个DNA样本进行PCR扩增，使用的探针为：探针A: 5′-CTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTG-3′，探针B: 5′-TAAAGAGATTCATTAACTTGACTG-3′ ；探针C: 5′-GCCCAAAGTTAGTAAT-TTTAC-3′ 。PCR的最终反应体系30μl，包括：250 ng DNA，每种探针30 pmol，250 mmol/L dNTPs，2.5 U Taq DNA 聚合酶 (Sangon，Shanghai.China)，2.5 μl 10PCR 缓冲液（50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0，0.1% Triton X-100，1.5 mmol/L MgCl2），首先进行95℃预变性3 分钟，PCR反应包括94℃ 1分钟，60℃ 2分钟，72℃ 2分钟，共30个循环。PCR扩增产物采用含0.5 μg/ml溴化乙锭的1.5% 琼脂糖凝胶电泳显影。% l: s* f$ H. \2 I$ `+ `$ d8 m5 N3 y0 Q5 k
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　　荧光原位杂交分析
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　　使用CEPX spectrumOrangeTM/Y spectrumGreenTM DNA探针试剂盒(Vysis inc.USA)进行FISH分析，以分辨男性或女性细胞。第5代患者MSC用甲醇：冰醋酸固定滴片，用70%甲酰胺2SSC进行标本DNA变性，73℃，5分钟，室温下不同浓度乙醇脱水，加10 μl探针后，42℃过夜，次日0.4SSC及2SSC/0.1% NP-40洗脱，10 μlDAPIⅡ复染核，使用荧光显微镜（Olympus BX-61，Japan）进行观察，每个样本计数500个细胞。ProbeChekTM 玻片(Vysis inc，USA)作为阳性对照。! W! d* Z# y$ p: e8 }2 c, q

　　结果
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　　MSC的生长及传代能力8 a1 q, [' m2 B/ J

　　34例患者MSC培养后31例(91.1%)均达到了融合；1例(2.9%)达到部分融合，2例(5.9%)未达融合，后3例患者均为临床上造血恢复极差的患者；24例患者MSC能成功传代5代以上，且可进行PCR、FISH分析。% `7 q2 Q4 y" H' Q  O$ f* U
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　　患者MSC的富集及鉴定5 N/ t- L1 m& W- v) W$ V
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　　在MSC的培养过程中，通过全量换液去除淋巴细胞，而如何去除骨髓基质中的混有的单核-巨噬细胞是非常重要的，因为巨噬细胞也是黏附细胞并能成为基质层的一部分［13］。本研究利用 0.25% 胰酶-1 mmol/LEDTA反复消化细胞以最大限度去除巨噬细胞，因为巨噬细胞对0.25% 胰酶-1 mmol/LEDTA不敏感，每次传代我们都更换培养瓶以进一步去除瓶壁上对此酶不敏感而未消化下来的巨噬细胞。FCM检测结果显示，患者各代CD44 CD29 CD45-CD14-细胞比例不同，0、2、3、4、5、6、9和16代CD44 CD29 CD45-CD14-细胞依次为32.47%±1.54，90.34%±2.11、95.23%±2.34、95.13%±0.93、96.68%±1.53、95.12%±3.28、92.19%±3.12和80.56%±4.23。CD44为黏附分子，CD29属整合蛋白家族，CD14、CD45为造血细胞表面分子，CD14为巨噬细胞相对特异性表面抗原，这说明所培养的细胞绝大多数为易贴壁的MSC，混有的巨噬细胞不多，我们选择第5代MSC用于PCR及FISH分析，其中CD44 CD29 细胞占（98.41±0.91）%，CD14 CD45 细胞占（0.039±0.02）% (图1)，这表明用于PCR及FISH分析的第5代MSC中，混有的单核-巨噬细胞数极低［（0.039±0.02）%］，低于PCR及FISH检查的敏感度（3%及1%）［10］。

　　患者MSC的植活嵌合分析
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　　对第5代MSC细胞我们进行了位于性染色体上的AMEL基因检查。AMEL是釉质母细胞分泌的一种基质蛋白，AMEL基因位于人类X和Y性染色体上，编码一种高度保守蛋白，女性（XX）有2个相同的AMEL等位基因，而男性（XY）有2个不同的AMEL等位基因［12，14-16］。电泳结果显示，女性为1个977 bp的单条带，而男性则为788bp和977 bp处两个不同的条带。本研究PCR结果显示：临床上造血植活的患者，其骨髓第5代MSC来源于患者本人(图2)。

对第5代MSC细胞利用双色荧光DNA探针进行了FISH 检查，CEP X DNA探针 (位于DXZ1区) 是位于X 染色体上(Xp11.1-Xq11.1)AT集中区的一个α微卫星DNA序列，荧光标记为橘黄色，CEP Y DNA 探针(位于DYZ1区) 是位于Y 染色体上Yq12区域的一个特异性的微卫星DNA序列，荧光标记为绿色。在荧光显微镜下观察：女性细胞的细胞核中显示2个相同的橘色荧光标记，而男性细胞的细胞核中显示1个橘色荧光标记，1个绿色荧光标记。本研究的FISH结果显示，临床上造血植活的患者，其骨髓培养扩增第5代MSC100%来源于患者本人(图3)。: _2 c& k( c: H) \9 Q

　　讨论9 @; `" U2 _7 a( E$ B. n$ f

　　Allo-HSCT越来越广泛地用于造血系统及非造血系统疾病的治疗中，而骨髓中的造血微环境与细胞外基质构成了骨髓的空间结构，其功能是否正常对于allo-HSCT之后的造血重建起着至关重要的作用［17-19］。allo-HSCT后造血植活的患者，其基质细胞的来源存在争议。Keating等［6］报告了14例患者，发现随着移植后时间的推移，患者的基质细胞逐渐转为供者源的；Simmons等［7］报告同胞HLA配型相合的10例患者，证明患者的基质细胞均为患者源的；Tanaka等［8］报告11例患者，其中7例患者的基质细胞均为患者来源，而4例患者的基质细胞显示了以患者为主的混和嵌合体； Koc等［9］证实移植后的患者 MSC源于患者；Cilloni等［10］报告11例去T细胞异基因HSCT患者，证明患者的基质细胞存在混和嵌合体； Awaya等［11］报告了4例患者，证明患者的基质细胞均为患者源的。) h# R6 m( @- a" b# u3 w8 {, n3 r6 N
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因此目前对allo-HSCT后患者MSC的来源问题没有定论，虽然大多数结论倾向于allo-HSCT后患者的MSC源于宿主本身，但纵观起来，这些研究还存在一些问题，比如对所研究的MSC没有进行有目的的纯化及鉴定，以去除可能混杂的巨噬细胞的影响［6-9］。尽管有些研究考虑到了巨噬细胞的影响，但其研究结果并不一致［10，11］。故关于这方面的研究有必要进一步进行下去，以明确allo-HSCT后患者MSC的来源，利于指导临床上的allo-HSCT的相关治疗，为是否在allo-HSCT过程中联合输注MSC提供理论依据。

本研究共分析了34例allo-HSCT患者，其中24例患者进行了PCR及FISH分析，结果证实其MSC均为患者源的。我们选择AMEL基因作为性别鉴定的方法之一，与单纯扩增Y染色体上的基因鉴别性别相比，其优势在于：检测方法同样简便、灵敏、准确，甚至可检测出仅1个细胞或部分降解的DNA 样本［20］，具有临床实用价值。X 特异性片段同时可做为内对照，防止由于Y 扩增产物的缺失而做出错误的结论。选择AMEL基因作为性别鉴定的方法，不论男或女，受检样本DNA如何，均可得出扩增产物，检测结果不受Y 染色体正常变异的影响，若检测不到扩增产物即意味着扩增失败。这一方法可防止由于试验操作过程任一环节失误或Taq 酶缺乏等因素而造成的假阴性结果。我们选择双色间期FISH 分析MSC分裂间期细胞，与单色FISH比较，也避免了假阴性结果的出现，同时结果非常客观且直观。( p% K' S9 z+ d; E4 P( X" O4 a' k; |% s

关于供者MSC没有植入的原因考虑有以下几个方面：首先，预处理方案没有完全清除患者的骨髓MSC以便供者的MSC植入。其次，供者的骨髓移植物中MSC含量太低（2-5 MSC/ 1106单个核细胞）也使供者的MSC不易植入［21］。第三，不同的输注途径和方法可能会影响MSC的植入； Richard等［22］在对1例重叠综合症的病人进行骨髓移植后，同时将从供者髂嵴获得的骨碎片进行腹腔内注射和直接注入受者的髂嵴，13 天后再静脉输入体外培养扩增的来自供者骨碎片的成骨样细胞，结果发现病人移植后1年骨髓黏附细胞66%、外周血细胞89%为供者来源，2年的时候，呈现95% 的嵌合，并且自身免疫病有显著改善。这一研究在证明基质前体细胞可以植入的同时，也提示不同的输注途径和方法可能会影响MSC 的植入。第四，患者原发性的基质缺陷也有助于供者基质植入，在Horwitz等［23］的一项研究中提示，如果正常的供者基质细胞和异常的宿主基质细胞相比处于竞争优势，它们就能够植入。在此项研究中，33名成骨缺陷的病人在接受常规骨髓移植后，有2人检测到供者来源的成骨细胞。基于以上的分析，补充输入供者MSC应有利于供者MSC在患者骨髓中植入。
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总之，本研究结果显示：allo-HSCT后临床上造血植活患者的MSC均源于患者本身，而患者的MSC逆转为供者来源是否对患者有益，补充输入供者MSC是否确实能使供者MSC在患者中植入尚需进一步的研究。% f" N1 }2 A* f4 l' N/ L
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