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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-2-15 23:32 编辑
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+ q" ^9 a/ Z+ t! V7 a* z
' Z5 d2 K4 r* [5 S1 {% J培养条件 / h& S/ n/ N; f' o, w
环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。 6 j: y6 i P g+ _* H% B
设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。
0 q5 r8 q4 E$ U+ O实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。
0 e0 X9 F% Z4 k* V试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。 J( O, \1 L" H( |% Q0 d
试剂的配制：
0 }2 w8 u; h) ^* Z5 \4 B x9 H- dDMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3 6 c' v, P8 C* @
MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素 $ r8 {) x/ K3 a( ]" `3 A4 W
ES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子
D( q1 l9 {* g+ `2 O* bD-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红 ! D" r( b) A' d. h& D' D5 P$ r. p
0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶
, {8 d! g p" h+ e' z# R) YES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO # m% H& C6 y, B# f
MEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO
8 j! V) c8 R8 QFeeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO 6 l7 V7 @8 c' H' L
丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制 7 O {$ z v* a4 F' w: s. Y
培养步骤
# A) T6 M% q; P3 ^0 `6 j常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
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q/ ~: S2 d; Y2 s1 W; T小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
" V$ L4 b4 n' }* C: z `9 _* c, q胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
9 G t1 d/ z0 u# ?- R+ ?+ I3 U$ y! W3 p0 m" j( S# M
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
+ N3 Z5 y3 G) c* y把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 ( ^. D3 V( i3 e; C
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
. l5 C$ G. F, |# O2 J' E根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 # A1 q% ^2 ?8 D
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备
3 U- O8 `# I4 R$ ^8 H5 l9 y把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
# X- r+ Q3 G' c# j! g把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
+ W1 J2 z4 h A; O2 K- ?用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 7 I* x! J: {" v3 v! z
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可）
/ B7 n7 n8 ~6 T! v m9 o$ t$ u一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
2 e4 a0 d* Z3 k' C9 J l小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
/ u' R, A- ^8 }) g在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。 0 C* N0 j0 i- B: f6 G
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
, G0 K( S6 H+ X" N) d, |吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
; C1 @4 ?5 F+ @. }根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 ( g0 E$ \- H3 j5 `! E6 L
小鼠胚胎干细胞的传代
6 S% g# e& c" K' o6 b4 M吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
2 g% `% h4 v5 `3 d: ~用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 * W0 V' H' n3 v
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 - Z" E8 F) [$ h
小鼠胚胎干细胞的冻存 . \7 H. Y) A# Z) U
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
$ R. D4 t9 m( _2 Q- b用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 8 u: ^' d# v, q! Q. r0 K6 V
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
9 M6 U; v. v- k- H注意事项
m! Z& [7 o8 R( D$ g6 t丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 * ~/ }" V1 h7 ]+ Z2 u' G9 M
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
& U( h/ l; @( I7 P3 B a* a% uES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
/ b5 H+ h9 {2 u, J5 t5 x为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。 |
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发表于 2010-9-5 19:56
