非清髓异基因外周血造血干细胞移植后嵌合体分析 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:23 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：陈宝安，熊辉霞，丁家华，苏恩本，赵刚，王骏，高冲，孙耘玉，程坚作者单位：东南大学附属中大医院血液科南京210009；1 江苏省人民医院中心实验室南京 210006   q' O' }* c+ [; b
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      【摘要】  本研究旨在探讨非清髓异基因外周血造血干细胞移植(NAPBSCT)后造血嵌合体的临床意义。采用FBC(氟达拉宾白消安环磷酰胺)±阿糖胞苷（Ara-C）预处理方案，对28例血液病患者进行NAPBSCT，采集供者和受者术前外周血及术后不同时间段的序列血样，用STR-PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染色和凝胶成像分析技术半定量方法计算供体细胞嵌合率。结果显示：移植后1月，28例患者中1例移植失败，22例形成完全供者造血嵌合体(CC)，5例形成混合造血嵌合体(MC)；移植后7天时供者细胞即占优势（74.71%），较中性粒细胞（ANC）和血小板（Plt）的平均恢复时间均明显提前；CC组的aGVHD发生率高于MC组（P＜0.05），两组cGVHD发生率无显著差异（P＞0.05）；1例MC患者发生早期移植排斥；CC组和MC组复发率无显著差异（P＞0.05），1例在CC状态下复发。3例MC患者经早期临床干预治疗获得CC和完全缓解。结论：造血嵌合体的动态定量检测对判断早期植入，预测移植物排斥、复发和GVHD，以及指导临床干预治疗具有重要意义。
      【关键词】非清髓造血干细胞移植6 u7 P$ z1 }; F; ~- o/ u
   　　Analysis of Hematopoietic Chimerism after Non-myeloablative Allogeneic Peripheral Blood Stem Cell Tansplantation' h4 H1 p9 i* M( e9 g
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　　CHEN Bao-An，XIONG Hui-Xia，DING Jia-Hua，SU En-Ben1，ZHAO Gang，WANG Jun，GAO Chong，SUN Yun-Yu，CHENG Jian

　　Department of Hematology，Zhongda HospitalAffiliated to Southeast University，Nanjing210009，China; 1 Central Laboratory，The People Hospital of Jiangsu Province，Nanjing210006，China; Q* K  K; f' r( P
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　　AbstractThe aimof this studywas toanalyze thehematopoietic chimerism after non-myeloablative allogeneic peripheral blood stem cell transplantation(NAPBSCT).28 patients received NAPBSCT were evaluated.The conditioning regimen included FBC (fludarabine，busulphan，cyclophosphamide)±Ara-C.Peripheral blood was collected before and after transplantation in different periods.Semi-quantitative assessment of hematopoietic chimerism was performed by short tandem repeat-polymerase chain reaction(STR-PCR)，polyacrylamide gelelectrophoresis (PAGE)andsilver staining，and analyzed by Image Analysis System.The results showed that on day 30 after transplantation，one patient failed to engraft，but 22 cases formed complete chimerism(CC) and 5 cases were of mixed chimerism.On day 7 after transplantation，the average percentage of donor cellswas 74.71%. The time of dominance of the donor-specific allelic pattern preceded the recovery time of neutrophils and platelets.The incidence of aGVHD in group CC was significantly higher than that in group MC(P＜0.05).There was no significant difference in the incidence of cGVHD and disease relapse between group CC and group MC（P＞0.05）.One patient relapsed in CC status without a transitional stage of MC.One patient with MC rejected grafts in early stage.3 patients with MC transferred to CC and got complete remission after early implementation of therapy.It is concluded that sequential and quantitative detection of chimerism may be of great value to evaluate engraftment and to predict graft rejection，disease relapse and GVHD.Furthermore，it may provide a basis for early interventiontreatment in the related complications.

　　Key words non-myeloablative stem cell transplantation;non-myeloablative allogeneic peripheral blood stem cell transplantation; CTR-PCR;hematopoietic chimerism3 q1 `" v0 p8 r2 H

　　非清髓异基因造血干细胞移植（NASCT）时由于减量的放、化疗预处理加上强效的免疫抑制，在移植后多形成供、受体细胞不同比例的混合嵌合体（MC）［1，2］，并呈动态变化。造血嵌合体的动态定量检测对判断早期植入、移植物排斥和白血病复发、掌握GVHD的发生规律、实施临床干预治疗、减少移植相关并发症、提高疗效都具有重要意义。我们采用STR-PCR结合凝胶电泳成像分析技术对28例接受NASCT治疗的患者进行了嵌合体的动态监测，并对其临床意义进行了分析。

　　材料和方法- u6 X$ p8 `/ i) m, o0 _4 \/ _

　　病例及供者
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　　2003年1月至2005年3月在我院血液科接受非清髓异基因外周血造血干细胞移植的患者28例，男19例，女9例，年龄15-58岁，中位年龄37岁。其中慢性粒细胞白血病（CML）19例，慢性淋巴细胞白血病(CLL) 1例，急性非淋巴细胞白血病(AML) 3例，骨髓增生异常综合征(MDS) 4例，非霍奇金淋巴瘤(NHL) 1例。供者28人，其中同胞供者24人，无血缘关系供者2人，HLA配型均为全相合；单倍相合亲缘供者2例，均DR位点不合。供、受者性别相合18例，性别不合10例。ABO血型相合21例，血型不合7例。供、受者具体情况见附表。5 d: i  R$ |3 |6 @/ p! s6 V

　　方法& p5 q% {, y( z! L) A

　　非清髓性预处理, a# |- K) ~# @( ]2 {

　　采用FBC预处理方案，即氟达拉宾（Flud）30 mg/m2，于移植前7-2天静脉点滴；白消安（BU）4 mg/（kg·d），移植前6-5天，口服；环磷酰胺( CY)350 mg/（m2·d），移植前3-2天静脉点滴，急性白血病和疾病进展期患者加用阿糖胞苷（Ara-C）。

　　外周血干细胞的动员和回输3 l9 y7 u' m7 B; K$ P3 @% ^

　　所有供者用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员外周血干细胞，5 μg/（kg·d）皮下注射，共5天，第5，6天用CS-3000 Plus血细胞分离机(Baxter公司)分离外周血干细胞2次，每次循环血量10 L左右。所有患者均接受未去T细胞移植物，输注单个核细胞数（MNC）平均为6.3108/ kg，CD34 细胞数平均为4.8106/kg。
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　　GVHD的防治
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　　采用环孢菌素A（CsA）联合骁悉(MMF)方案，即CsA 3 mg/（kg·d），移植前1天开始给予，持续24小时静脉滴注，正常进食后改为口服，维持血药浓度在200-400 ng/L，至100天停药。MMF 1.0 /d，分2次口服，从移植后1-27天应用。无关供者移植的病例加用短程甲氨蝶呤（MTX），即移植后第1天为15 mg/m2，第3，6，11天为10 mg/m2，静脉滴注。3 ?0 d( t, c) U( _
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　　嵌合体检测7 \6 p' J6 q8 {* w; u3 @0 y7 {# B

　　术前采集供者和受者外周血2 ml，术后7、14、21和30天采集患者外周血，此后根据患者随访时间采集外周血，每月1次或每3月1次。移植后早期每次采血5 ml，此后每次2 ml，ACD抗凝，于采血后24小时内用红细胞裂解液裂解红细胞，提取白细胞，Chelex-100法快速提取基因组DNA。按文献选择D5S818、D13S317、D3S1358、D8S1179、D7S820、D16S539、FGA、vWA 8个STR位点进行PCR扩增［3，4］，经非变性非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色法鉴定PCR扩增产物，最后用UVP凝胶成像分析仪进行扫描成像分析，选择各自的嵌合体计算公式［5］，以供、受者特异性等位基因带的峰面积比值计算嵌合率，结果取所有I类和Ⅱ类位点的平均值［6］。
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　　嵌合体界定 4 l7 K: z# C5 ~  C# k- r  O( Z* R
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　　供体细胞（DC）＞95%为完全嵌合体（CC），5%＜DC＜95%为混合嵌合体（MC）［7］。Table.Clinical characteristics of patients and donors（略）
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　　统计学处理题
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　　应用SAS 8.0统计软件进行分析，采用Fisher精确概率法计算P值。* p1 x) [( p7 W" K$ y
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　　结果

　　造血嵌合体的形成和演变
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　　以移植后1月为界判定造血细胞嵌合体，28例患者中1例MDS-RA的患者移植失败未检测到嵌合体，自体造血亦未恢复而死于严重感染。余27例患者均形成不同比例的造血嵌合体，其中22例形成CC（81.48%），5例形成MC（18.52%）。随访1.5-27月，平均11个月，22例CC患者中3例随后出现DC下降和受者成分的增加，并相继出现白血病复发；1例在CC状态下复发，18例保持稳定CC。5例MC患者中，1例CLL患者早期出现移植排斥，经2次供者淋巴细胞输注（DLI）后逐渐达到CC；2例早期复发，其中1例死亡，1例经二次标准移植后获得CC；1例首先出现细胞遗传学复发，DC进一步下降，迅速转变为完全受者型造血，临床血液学复发；另1例MC患者移植1个月后三系细胞进行性下降，脾肿大，骨髓增生明显活跃，诊断脾功能亢进，STR-PCR检查持续MC，移植后4个月时行脾切除治疗，8个月时转为CC。

　　造血嵌合体与造血恢复

　　从移植0天开始血常规监测，每天1次，造血恢复后改为每周3次至移植后1个月，造血重建的标准为ANC＞0.5109/L和Plt＞20109/L［8］。在获得造血重建患者中，ANC最低的平均时间是6.59天（2-10天），ANC>0.5109/L的平均时间是11.68天（8-15天），Plt最低的平均时间是8.40天（4-12天），Plt>20109/L的平均时间是16.24天（9-35天）。所有稳定植入的患者在移植后7天时的平均嵌合率是74.71%，移植后14天多数病例达CC。& ]9 n$ p! p- \' l# W8 C
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　　造血嵌合体与GVHD) E) G9 I: h' r! y" O1 Y
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　　在形成造血嵌合体的27例患者中，共计有 18 例（66.67%）发生了aGVHD。在CC组17/22例（77.27%）发生了aGVHD，其中Ⅰ-Ⅱ级12例，Ⅲ-Ⅳ级5例；MC组1/5例（20%）发生Ⅱ级aGVHD，CC组aGVHD发生率高于MC组（ P＜0.05）。在可评估的患者中，共有12/21例（57.14%）发生了cGVHD，CC组11/17例（64.71%），其中广泛型cGVHD 4例，局限型cGVHD 7例；MC组仅1/4例发生局限型cGVHD（25%），但因例数较少，差异无统计学意义（P＞0.05）。5例发生胃肠道和（或）肝脏严重aGVHD的患者中，4例在治疗过程中因病情难以控制或经济原因放弃治疗在移植后3个月内死亡，1例治疗后病情好转，但迁延为cGVHD，于移植1年后死于GVHD。1 j* u- A3 N* L0 i
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　　造血嵌合体与移植排斥和白血病复发
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　　本研究中仅1例CLL患者发生早期移植排斥，移植后1个月时仅在部分STR位点有少量的供者型遗传标记存在（DC 27%），但血常规检查提示造血恢复，考虑为早期移植排斥，自身造血恢复，及时给予DLI 治疗2次，移植后3个月时已接近CC（DC 90%）。7例出现疾病复发，时间在移植后1.5-16月，其中CC组4/22例（18.18%），MC组3/5例（60%），但因例数较少，两组差异无显著性（P＞0.05）。复发的患者中5例为移植前处于疾病进展期或多次复发难治性病例。值得注意的是，1例AML的女性患者持续保持CC及无白血病生存状态达16月，诊断血液学复发时外周血STR-PCR检查仍提示CC，该患者在复发前并无MC的过渡状态（图1）。
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　　造血嵌合体与临床干预治疗
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　　对处于MC状态和出现DC下降的患者，为预防复发和移植排斥，都进行了临床干预治疗，3例取得了较好疗效。1例早期移植排斥的CLL患者在经过2次DLI后逐步达到CC，现已无病生存12个月。复发最早的 1例25岁的男性患者来我院检查时已为慢性粒细胞白血病急变期，因病情进展快，未予化疗，直接用其母作为供者进行移植，移植后1个月时STR-PCR检查DC在60%，行DLI1次，并减少免疫抑制剂的用量，移植后1.5月时外周血涂片原始细胞比例30%，立即经标准预处理后予第2次移植，移植后50天时达CC，维持无白血病生存状态8个月，最终死于二次复发。尚值得注意的是，1例移植后合并全血细胞减少诊断脾功能亢进的CML患者在移植后8个月切脾治疗后血象恢复的同时由嵌合MC状态转为CC，现已无病存活25个月（图2）。1 e* g" P1 p. s1 t6 U
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　　讨论' a6 Z2 X4 r6 X) `% h

　　嵌合体形成受到疾病本身、预处理方案、输入干细胞的数量、移植物是否去除T细胞、检测方法的敏感性和检测时间等多种因素的影响［9］。本研究病例形成完全嵌合体的比例高（81.48%），且CC获得时间较早（多数病例在移植后14天达CC），这可能与我们采用的预处理方案较强，同时输入了较多量外周血T细胞有关。Yoshida等［10］指出，非清髓性预处理强度有很大的范围，一般来说，用含氟达拉宾的预处理方案作用较强，多形成CC，而用含ATG，TBI的方案则40%形成MC，但可通过DLI转变为CC，究竟采用何种预处理方案，应根据复发率决定。因此，单纯从形成嵌合体形成类型方面评价预处理方案的优劣是不全面的，必须从远期和整体疗效加以判断。选择预处理方案应考虑受者基础疾病的性质和状态，受者的年龄、脏器功能、并发症及HLA相合情况等。: Z- A/ n8 o0 c3 M+ Z- q7 K
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造血恢复是判断移植成功与否的重要指标，但NASCT后即使未成功植入，自身造血也有可能恢复，因而不能判断造血来源，不能排除成份输血造成的假象。Dubousky等［11］将移植后供者细胞首次占优势的时间，即DC首次大于50%的时间定义为分子水平植入，一般比造血重建早4-7天，本研究获得稳定造血重建的患者在移植后7 天时供者细胞就占优势（DC 74.71%），这比ANC和Plt平均恢复时间明显提前，因此即使在移植早期造血抑制期间，也能判断移植成功与否。

异基因造血干细胞移植后GVHD制约着其在临床上的应用，人们一直在探索如何减轻GVHD而不减少GVL效应。理论上NASCT通过诱导供受者双向免疫耐受，可使GVHD的发生率低且程度轻。但本研究中GVHD的总发生率和相关死亡率都较高，且CC组aGVHD发生率明显高于MC组，这一结果可能与我们采用的预处理方案较强且移植物未去T细胞，CC获得较快有关。有学者认为，先经过高比例MC再逐步转化为CC可能是一种更好的避开aGVHD的植入方式［12］。DC的定量检测，尤其是供者T细胞亚群的监测有助于发现GVHD的高危患者，利于加强GVHD的防治。0 a5 g  N4 [% S3 b6 F* S

有关MC与复发的关系，目前存在较多争议。多数研究认为，MC与较高的复发率相关，持续CC则与低发生率的复发相关联［11，13］。但有研究得出的结论是MC本身不表明预后差，受者成分的突然增加预示复发［9］。本研究中，复发的7例患者中5例为处于疾病进展期或多次复发难治性病例，CC组和MC组复发率无显著差异，与Furukawa等［14］的研究结果相似。随着对细胞亚群嵌合体研究的深入，发现髓系混合嵌合体与髓系白血病的复发有关，而与淋巴系统白血病的复发无关［5，13，15］。值得注意的是，本研究中1例AML的女性患者持续保持CC及无白血病生存状态达16个月，诊断血液学复发时外周血STR-PCR检查仍提示CC，即该患者在复发前并无MC的过渡状态。李素霞等［16］也有类似报道。这些结果提示复发可以不伴随从完全供者嵌合体到混合嵌合体的转变，考虑原因有两方面，首先可能与嵌合体检测方法的灵敏度有关，其次患者可能确实系供者型复发，但供者源性的白血病多与受者原有的白血病类型不同［17］。Bader等［15］解释此种现象可能是因为急性白血病复发较快，而检测嵌合体的间隔较长，刚好错过了短暂的一过性MC状态。因此对于某些可能在移植后短期内复发的高危患者，Thiede等［18］推荐应积极检测嵌合体：移植后第1个月内每周2次，移植后3个月内每周1次，3个月后至少每月1次，一旦发现DC下降，应尽早给予干预性治疗。嵌合体定量检测技术现已成为MRD的检测手段之一，尤其是对于无特异性肿瘤标志基因异常的恶性血液病患者更为适用。" \3 W8 K* }" K8 d$ T/ L! q+ N

免疫抑制剂调整、DLI和第二次移植是NASCT后主要的临床干预治疗，但本身应用不当可带来相关的毒性作用和并发症，或延误治疗的时机。造血嵌合体的动态定量检测对实施临床干预治疗、提高疗效具有重要的指导价值［13］。我们研究的3例患者在嵌合体监测下经临床干预治疗取得了较好疗效。1例CML急变期移植后随即复发的患者经过第二次标准移植，获得CC，并无病存活8个月，虽然最后死于二次复发，但难治性白血病通过第二次移植能重新获得CC并达到完全缓解的成功经验也是令人鼓舞的。另外，切脾治疗使得1例移植后合并脾功能亢进的CML患者在血象恢复的同时由MC转为CC，并长期无病生存。因此，我们认为，脾切除不仅可以促进造血的恢复，还可促进CC的形成［19］。Richard等［20］也认为，CML患者移植后造血功能恢复不良者可通过脾切除加以纠正，其疗效优于第二次移植。
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随着造血干细胞移植工作的不断深入，嵌合体的长期监测就显得越来越重要了，必将成为移植后的常规检查项目。随着嵌合体检测方法的标准化，嵌合体的临床意义也将更加受到重视。对于造血嵌合体与移植排斥、白血病复发及GVHD的关系的明角尚需积累更多的病例，增加单病种的样本含量并从细胞亚群嵌合体的角度揭示其内在联系。# l: F% J- K/ p1 z7 w- f4 d+ l
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