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作者：李栋，沈柏均， 侯怀水，时庆， 张乐玲1，马秀峰作者单位：山东大学齐鲁医院低温医学研究室， 济南 250012； 1 山东大学齐鲁儿童医院内科， 济南 250022基金项目：国家自然科学基金资助，编号：30271248
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【摘要】 为了研究兔骨髓间充质干细胞(rBM-MSC)的生物学特征及其对不同生长因子的反应，使用贴壁培养法从兔骨髓单个核细胞中获得间充质干细胞（MSC），在光学显微镜和电子显微镜下观察其基本生长行为和生物学特征；使用流式细胞仪检测rBM-MSC的免疫学表型；RT-PCR法检测其胶原表达；诱导rBM-MSC多向分化并使用特异性染色和RT-PCR予以鉴定；最后使用MTT法检测IL-1、3、8和HGF对rBM-MSC生长增殖的影响。结果显示：贴壁生长的rBM-MSC具有典型的成纤维样细胞形态，可传15代以上，第5代rBM-MSC高表达基质受体CD44（32％），低表达造血细胞标记CD45（4.7％）；RT-PCR显示高表达I型胶原，弱表达II型胶原，不表达X型胶原；在不同的诱导条件下，rBM-MSC 可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。rBM-MSC对IL-3最为敏感，10 ng/ml的低浓度IL-3可显著促进细胞增殖达32％以上（P/ B7 R+ C5 a% l! B4 j3 q$ Y
【关键词】骨髓； 间充质干细胞；生长因子；兔
! n- s8 A9 K, x, b+ D9 x8 Y Biological Characteristics of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Their Response to Different Growth Factors
! I3 P# u% R1 G. f# m9 g2 A
, E2 a( P& T. U; @. R) ^ LI Dong，SHEN Bai-Jun, HOU Huai-Shui, SHI Qing, ZHANG Le-Ling， MA Xiu-Feng
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Departmentof cryomedicine, Qilu Hospital, Shandong University, Jinan 250012, China；1Department of Internal Medicine,Qilu Children Hospital, Shandong University, Jinan 250022, China/ [5 W9 Y9 A& J& V6 b( s
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AbstractThis study was aimed to analyze the biological characteristics of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (rBM-MSCs) and their response to different growth factors. Rabbit BM-MSCs were separated from bone marrow mononuclear cells by using adherent cultivation. Biological characteristics were investigated by optical and electron microscopy. Immunophenotype of rBM-MSCs was measured by flow cytometry. The expression of collagen was detected by RT-PCR. Differentiation potential was identified by specific staining and RT-PCR. The response of rBM-MSCs to IL-1, 3, 8 and HGF with different concentrations were tested by MTT. The results showed that the rBM-MSCs gave rise to a population of adherent cells characterized by the presence of a predominant cell type with a typical fibroblast-like morphology and could be cultured for over 15 passages. CD44 was highly expressed on F5 rBM-MSCs (32%) and CD45 was lowly expressed (4.7%). Type I collagen was highly expressed, while type II collagen was lowly expressed and type X collagen was not detected on rBM-MSCs using RT-PCR method. In variousconditions inducting differentiation, rBM-MSCs could differentiate into the osteoblast, chondrocyte, adipocyte and neuron-like cells. The rBM-MSCs were sensitive to IL-3, even low concentration (10 ng/ml) of IL-3 could promote the proliferation of rBM-MSCs effectively (>32％, P
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4 U' A6 |2 S+ V' a4 E Key wordsbone marrow; mesenchymal stem cell; growth factor; rabbit- j# R0 K+ t D7 o* A4 f+ s& `) A" c
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骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC）具有高度自我更新和多向分化的潜能，在不同的诱导条件下，可分化为多种组织细胞类型，如骨髓基质细胞、成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞［1］。目前对人和小鼠等物种的BM-MSC$ ]* o! O: v& B7 E+ }0 D
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已有深入研究，但对兔BM-MSC的生物学特性，尤其是其免疫学表型和对不同生长因子的反应鲜有报道。兔的形体较大，便于进行移植和观察，对兔BM-MSC的生物学特性进行深入的研究对实验生物学具有重要意义。本研究采用贴壁培养法，在体外培养、扩增兔BM-MSC，对其形态特征、表面标记、多向分化功能以及对不同细胞因子的反应进行初步研究，为以后的移植模型研究奠定基础。% p7 S6 Q' g4 ~- z) K @
8 w |( I; M9 X7 x2 C. ]" h 材料和方法
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实验动物
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7 t6 o+ t- R) E6 V 3月龄雄性新西兰大白兔6只，体重1.8± 0.2公斤/只，购自山东省农科院兔场。$ s5 D, X" W: ^* V
1 \+ N1 n7 T3 b" [3 S4 N 兔BM-MSC的分离培养 - E# p% u0 r* n- B
2 t+ n, T: y% J 对兔按3％戊巴比妥钠1 ml/kg体重行耳缘静脉麻醉，无菌取股骨骨髓1 ml（肝素终浓度50 U/ml）。用淋巴细胞分离液（上海华精生物公司产品，相对密度1.077）获得单个核细胞，以4105/ml的密度悬浮于含10％小牛血清（杭州四季青产品）的高糖DMEM（Gibco/BRL公司产品）中，置100％湿度、5% CO2、37℃条件下培养72小时后全量换液，弃非贴壁细胞，每3天全量换液，约2周后贴壁细胞铺满80％瓶底， 用0.25％胰蛋白酶（Gibco/BRL公司产品）常规消化传代。5 S# H! A& _/ ?- ~- x
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电子显微镜观察和细胞组织化学染色$ z# r( ^7 }1 o# W4 Q8 @1 B
4 w* Q+ ?. h- n- V! I/ s, p 取第5代BM-MSC进行扫描电子显微镜和透射电镜观察，并进行常规碱性磷酸酶染色（ALP）和糖原染色（PAS）。% f3 _1 M$ @, F6 K8 l( v
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免疫表型检测 , {* d0 \# N1 F( Q
& F3 j+ J: S& y I7 A& p$ |& ] 取第5代处于对数生长期的BM-MSC，消化后用含0.1％BSA的PBS悬浮，调整密度为1106/ml，分别标记鼠抗兔CD44、鼠抗兔CD45和鼠抗MHC-I型分子抗体（IgG1，Serotec公司产品）10μl，室温放置30分钟；另取1管作IgG同型对照；以缓冲液洗去未结合抗体，再加入200 μlFITC－羊抗鼠二抗（IgG，BeckmanCoulter公司产品），避光孵育20分钟，缓冲液洗去未结合抗体，流式细胞仪（CYTOMICSTMFC 500型，Beckman Coulter公司产品）检测，结果用CYTOMETER 1.0软件分析。
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诱导分化及鉴定; o3 [ c+ C% Z$ C6 o3 s; Y
5 e- q' ` x6 v 成骨细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC，约60％融合时加入成骨细胞诱导培养液（含10％小牛血清，地塞米松0.1 μmol/L，维生素C 0.2 mmol/L，β-甘油磷酸钠50 mmol/L，Sigma公司产品），每3天全量换液1次，2周后行碱性磷酸酶染色和茜素红S染色。6 Q7 M3 P" A6 r+ @, E
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软骨细胞取培养第5代处于对数生长期的BM-MSC，约60％融合时加入软骨细胞诱导培养液（含10％小牛血清，TGF-β1 3ng/ml（PeproTech EC公司产品），地塞米松 0.1 μmol/L，β-甘油磷酸钠 5 mmol/L，维生素C 0.2 mmol/L，胰岛素 2μg/ml，丙酮酸钠 30 μg/ml，牛血清白蛋白 0.4 mg/ml，亚硒酸 2μg/ml，亚油酸 2μg/ml，Sigma公司产品），诱导2周后甲苯胺蓝染色检测胶原表达，RT-PCR检测软骨特异性Ⅱ型、Ⅹ型胶原和aggrecan基因表达。 w ]2 D; ~% } D
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脂肪细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC，约90％融合时加入脂肪细胞诱导培养液（含10％小牛血清，胰岛素6.25 μg/ml，地塞米松 0.1μmol/L，IBMX 0.25 mmol/L，吲哚美辛 100 μmol/L（均为Sigma公司产品），2周后油红O染色鉴定。
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神经细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC，约90％融合时加入预诱导培养液（含10％小牛血清，bFGF 10 μg/L（PeproTech EC公司产品），48小时后加入神经细胞诱导培养液（含10％小牛血清，1％ DMSO，BHA 50 μmol/L，Sigma公司产品），3天后RT-PCR检测神经细胞特异性nestin和NF-M基因表达，免疫组织化学鉴定神经特异性抗原NSE的表达，一抗为鼠抗兔NSE，二抗为生物素化羊抗鼠IgG（武汉博士德生物公司产品）。
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基因表达的RT-PCR检测
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& x: ? l0 O% D" B% P) ` 细胞总RNA提取使用TRIzoL试剂 (Invitrogen公司产品),反转录按照RT-PCR试剂盒（购于北京博大泰克生物公司）说明书操作。所得cDNA用于PCR扩增，引物见附表（上海博亚生物公司合成）:扩增程序为95℃ 30秒，65℃ 45秒，72℃ 45秒，5个循环；95℃ 30秒，60℃ 45秒，72℃ 45秒，20个循环；95℃ 30秒，55℃ 45秒，72℃ 45秒，4个循环；最后72℃ 延伸10 分钟，PCR产物使用 2% 琼脂糖凝胶电泳分析。 l' c; O" t1 I. s
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不同细胞因子对兔BM-MSC增殖的影响* J. h4 w. V2 [( I: ~8 Z7 J" ?; O" z
% ]0 ~+ X7 X$ A' O7 s 取第5代处于对数生长期的BM-MSC，以2 000个细胞/孔的密度培养于96孔板中，培养基为含10％小牛血清的高糖DMEM，分别加入不同浓度的IL-1、3、8和HGF（PeproTech EC公司产品），每组设12个复孔，培养48小时后常规MTT法检测MSC对不同生长因子的增殖反应，酶联检测仪(INTEC公司产品，Reader 2010型)检测492nm处吸光值。Table.Primer sequence（略）' c7 W+ t' C, m
" z$ h8 e2 k$ T0 q! u 统计学处理
, b* x. u G* k% k& S5 {9 \8 A, U" p8 V+ p( x ~
计量数据用X SD表示，组间差异分析用 t 检验,P1 U$ |. m3 V3 F# `9 B; G
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结果; M" E6 j, n2 S# Q1 E
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细胞形态及特异性染色+ R+ D: g `( K7 Z. k
) F8 R* ]( _/ t8 g c7 H' j' k 兔骨髓单个核细胞在贴壁培养72小时后可见少量细胞贴壁，10天后BM-MSC能铺满80％瓶底，以成纤维样细胞为主，HE染色可见核内有2-4个明显核仁（图1A）；扫描电子显微镜下可见大部分细胞表面光滑（图1B），少数梭形细胞有丰富的表面片状皱褶；透射电子显微镜观察显示，膜光滑有少量微绒毛的成纤维样细胞占大多数，该细胞核与细胞质比约为1∶5，细胞核中常染色质丰富、分布均匀，图1C可见双核仁，核仁大而结构清晰，核膜完整，可见内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体和一些髓鞘样小体，胞质中分别有大量核糖体和微丝。BM-MSC细胞膜微绒毛较多，靠近这些突起的细胞质中分布有致密的微丝，形成一条高电子密度带（图1D）。细胞化学染色2%-3％的细胞碱性磷酸酶阳性，在胞质内有红棕色沉淀，阳性细胞在形态上与阴性细胞没有差异（图1E）；糖原染色全部细胞均为阳性，胞质含大量紫红色糖原颗粒（图1F）。
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. R$ H8 g5 T& r 诱导分化结果及其鉴定
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加入成骨细胞诱导培养液2-3天后，细胞开始从长梭形缩短为多角形，细胞体积增大，诱导14天后茜素红S染色为阳性，碱性磷酸酶阳性细胞大幅增加，表现出成骨细胞的特点（图2A-C）；加入软骨细胞诱导培养液后，细胞由长梭形显著缩短为椭圆形，体积增大，甲苯胺蓝染色呈阳性（图2 D、E）。RT-PCR结果表明其表达软骨细胞特异性的aggrecan基因，Ⅱ型胶原的基因表达也较诱导前增多，表现为软骨细胞分化的特点；但Ⅹ型胶原不表达（图2 I: 1-4）；成脂肪细胞诱导后细胞胞浆内开始出现细小脂滴，细胞排列无序，显微镜下可观察到高折光性的脂滴。油红O染色显示脂肪细胞内大量的大颗粒状脂滴（图2F）；神经预诱导剂加入后细胞形态变得细长，加入二次诱导剂后6小时内约有60％的细胞死亡脱壁，剩余的细胞有50％表现为神经元样细胞特有的形态，伸出细长的伪足（图2G，H）。这些细胞表现为NSE免疫组化染色阳性；RT-PCR结果显示其表达神经细胞特异性基因Nestin和NF-M（图2 I: 5-6泳道）。- R$ F/ @% H9 L3 }
: m; ~- f7 u4 J, j& I- `
细胞表型及RT-PCR检测
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+ T, Q* U0 ~0 r4 \ 兔BM-MSC细胞上CD44抗原表达阳性率为32％；CD45表达阳性率为4.7％，MHC-Ⅰ型分子表达阳性率为1.8％；流式细胞仪测定结果见图3A-D。RT-PCR显示第5代的兔BM-MSC高表达Ⅰ型胶原，弱表达Ⅱ型胶原，不表达X型胶原、aggrecan、nestin和NF-M基因（图3E）。* S" c5 C# v# [3 h
6 p5 w) O" \: N. l* X6 B& N! R 不同细胞因子对兔BM-MSC增殖的影响
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1 r3 [6 x' v3 o2 q3 \1 b! h 酶联检测和MTT结果显示，兔BM-MSC对IL-1、3、8和HGF的反应模式基本相同，均为低浓度促进兔BM-MSC的增殖，高浓度反而抑制细胞生长，抑制效应随细胞因子浓度增加而增加；兔BM-MSC对IL-3的反应最为明显，10 ng/ml的IL-3可显著促进细胞增殖达32％以上（P V( v; g3 {8 r6 B5 ]
( n8 x2 Y: g. l% e* Z W: V 讨论# i' O: e( z* T( R# [1 X1 T
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目前分离MSC的方法多基于其黏附贴壁和体外快速增殖能力，鉴定MSC则主要是根据其形态和功能。目前普遍认为BM-MSC表达CD13、CD29、CD44、CD59、CD105、CD166和HLA-ABC，不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117和HLA-DR［2］。由于兔基因组计划尚未完成，兔分化抗原的抗体难以得到，本实验仅能选择CD44和CD45。细胞黏附分子CD44属于基质受体（matrix receptor），是分布极为广泛的细胞表面单链穿膜糖蛋白，在淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞表面均能检测到它的表达，专一性结合透明质酸盐并介导其内吞，在细胞-细胞和细胞－基质间作用中发挥重要作用［3］。我们的实验结果显示，约1/3的兔BM-MSC表达CD44，与猕猴BM-MSC的数据相同［4］，但较人BM-MSC的数据（>94％）为低［5］，这证明了物种间存在差异。我们培养得到的兔BM-MSC高表达I型胶原，弱表达Ⅱ型胶原，不表达Ⅹ型胶原和aggrecan基因。胶原是细胞外基质的主要成分之一,目前已发现 19种胶原分子,I型胶原的分泌是MSC的标志之一，可有效地促进BM-MSC的黏附、增殖和分化［6］，有关报道证明，如将人BM-MSC向软骨细胞方向诱导分化，则aggrecan基因、Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原的表达就会显著增加［7］，我们的试验结果显示，将兔BM-MSC向软骨细胞方向诱导分化后，表达aggrecan基因和Ⅱ型胶原，而不表达Ⅹ型胶原，这与人BM-MSC数据有差异。兔BM-MSC除向软骨细胞分化以外，我们还成功地使其诱导分化为骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞，证明了其具有多向分化潜能。骨髓中BM-MSC的含量仅占1/106个有核细胞，并且随着年龄的增加或体质的衰弱，BM-MSC的数量逐渐减少［8］。因此要获得足量的MSC，大量扩增纯化是十分必要的。根据我们的实验结果， 第5代之前的兔BM-MSC具有旺盛的增殖速度，倍增时间约为40小时，细胞形态狭长；从1 ml骨髓中获得的BM-MSC传代7-8次所得细胞数目可达5108，已经能够足够满足体内移植和一般实验研究所需。随着重复传代，细胞变得宽大，生长速度下降，这和人BM-MSC中的研究结果相似，随着BM-MSC的衰老，其对生长因子的反应能力和多向分化能力也会显著下降［9］。BM-MSC除表达IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、 LIF、G-CSF、GM-CSF、M-SCF、FL 和SCF等多种细胞因子外，还能对bFGF、BMP、胰岛素、TGF-β1和HGF等多种细胞因子作出增殖或分化响应，证明其表达多种因子受体［11-13］。本实验检测了不同浓度的人IL-1、3、8和HGF对兔BM-MSC生长的影响。结果显示，低浓度的人IL-1、3、8和HGF能促进兔BM-MSC的增殖，而高浓度则抑制其增殖，其中低浓度IL-3对兔BM-MSC的促增殖作用最为显著，而高浓度的IL-3的抑制效果也较其他细胞因子明显。BM-MSC本身不表达IL-1和IL-3［11，13］，IL-3主要由活化的T细胞产生， 而IL-3受体主要表达于造血细胞上并介导造血细胞的增殖、分化或激活。有文献表明，人脐静脉内皮细胞也表达IL-3受体，并可被TNF或IFN上调。混合IL-3 和IFN可上调脐静脉内皮细胞表达MHC II类分子并分泌IL-6和G-CSF等造血生长因子［14］。根据我们的结果，IL-3受体也表达于BM-MSC，IL-3可能通过IL-3受体促进BM-MSC的增殖并使其表达更多的造血生长因子。总之，本研究成功地分离、培养了兔BM-MSC，检测了其免疫表型和多向分化能力，与文献报道的其他物种MSC的特性类似，并检测了不同生长因子对其生长增殖的影响，为下一步应用兔作为移植模型的研究奠定了基础。 d' @ B8 b1 f! N
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发表于 2009-3-3 12:24
发表于 2015-6-15 14:53
