丝裂霉素C是如何配制和保存的？

qiongyacc

我们实验室采用DMEM配制成2mg/ml，分装成20微升每支后-20避光保存，每次配工作液只用20ml就够了，配多了用不完，放在4°超过2周效果就不好了，一般处理MEF三个小时，含5%FBS的DMEM在培养箱中洗3次，每次5min。
& R5 A6 H: ^0 D8 A5 E3 r: n这样做的原因是：原来用pbs冲洗5次，到第五次时会有些细胞漂浮起来浪费；当用pbs冲洗只能冲洗掉细胞表面的丝裂霉素C，用这种feeder做es培养后发现es长的很慢（可能是丝裂霉素C残留抑制es生长）；而在培养箱中用含血清的培养基冲洗，放置5min让细胞通过浓度梯度将细胞内残留的丝裂霉素C交换出来，尽量将少残留，这样培养的es增殖速度明显加快，大家不妨试试！
% t% |- v8 ]' N: I  k4 c2 o- N不足之处，敬请指出，相互促进！！

fespysok

我刚做了处理MEF的实验，10ug/ml的丝裂霉素处理3h,消化后计数再铺板1d后，多数细胞不再贴壁，这是什么原因，请大家帮帮忙解答一下？？？？

qiongyacc

回复 12# fespysok 5 g: ]+ j1 M; d% F

3 W0 F+ |, b; `可能的原因：- [: W- d8 W7 S5 ]% x. @' b
1.预先要用gelatin铺板，促进feeder贴壁！
- l; Z9 x6 v3 @7 F* x2 l4 m: ~2.不同批号的丝裂霉素C作用效价不同，要是3小时细胞都不贴避考虑一下是不是因为处理时间太长了细胞死了，可以减少处理的时间，文献上报道是2-3个小时，你可以试试2个半小时或者2个小时，把自己的实验条件定下来再做就顺利了！
- N7 P# R6 ~# X6 [ 3.你们单位有钴60当然最好了，用放射处理可以避免丝裂霉素C残留对es的影响！
, j/ j+ w- r% G5 ~# b. P祝好！

fespysok

谢谢！

liuer0041

制作MEF时细胞状态很重要，3代以内的最佳，通常是一次培养大量细胞，集中处理好冻存起来以后每次复苏来用，杀一只孕小鼠可以冻几百管处理好的MEF，所以直接将丝裂霉素C按10ug/ml溶解到培养液中即可，处理2小时，PBS洗一次，消化收集细胞，冻存。记得加丝裂霉素C处理之前先做支原体检测！

pheebs

我也是用pbs配的，1mg/ml，但是有很多颗粒不容物，这是怎么回事呢？

huanmiao2005

我一般处理2小时

573639471

回复 qiongyacc 的帖子9 u. \! {8 l( f

5 S- c0 m" B& W5 L( N. N处理时比如t25瓶 加几毫升10μg/ml 丝裂霉素C啊？

sizhengliu

回复 qiongyacc 的帖子
# S& Q2 R# N( W/ i9 b, ]: e7 M* _& h+ P
请问你们用MMC处理MEF后，会再消化、计数、重新铺板吗？

sarah19860420

回复 mmssyyee 的帖子
/ ?3 v6 D! I# Z: X* f7 n, N, A1 F0 C6 Z" U" N, g6 b7 w1 T
有的人说PBS洗5遍后，在消化等他铺到单层，再接种细胞，到底是什么样的顺序，搞不懂了。是不是可以直接洗后就直接接种细胞啊？