ES传代的话，feeder怎么办？

zhaoyan1983

听说feeder经丝裂霉素处理后，活不了多久，那么如果要对ES进行传代的话，还需要重新制作feeder吗？另外，酶消化之后，原来的feeder也跟着消化下来了，这样根本没有办法分辨ES和feeder，这样的话要怎样给ES传代啊？

上海过客

各张各的 ，井水不犯河水 。 直接消化以后 传代 ， ES细胞会形成克隆的。
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如果不放心，可以采用差速贴壁的方法来做   。  纯化 ES细胞后 计数再传代，这样做是最好的。  关于差速贴壁的方法
7 k; g9 n: e' f       消化后的细胞 ，计数按照10CM dish  250-  275万细胞 种植 ，培养基 ES培养基
$ {3 U* o+ h0 T8 O! b       混匀后 培养箱静置1小时 $ Y- C  g1 B. I/ `# c% K7 [1 c1 ~
       轻轻混匀后，吸取上清，离心1000RPM 5Min  8 p6 H( ?. K6 k$ g& h
          重悬后细胞计数 ，然后种植于6孔板。每孔，我的实验感觉 8万-10万细胞 较合适。- A/ B4 l9 y( U/ f' p5 S
       两天肯定长的边缘光滑发亮，很饱满的 克隆 。
+ ^" N9 x  O3 G, D* s  s1 B, [6 B5 v* s) R+ V; q
       两次细胞计数的目的 1  了解细胞数目
+ G& L0 L0 L5 f( h& o; ]1 z                          2   贴壁纯化前和纯化后 细胞的形态 作为 纯化是否成功的指标。0 C) w0 K( y- i4 l( g3 f' D0 p- I( E
                              纯化之前 ES+MEF 有圆形细胞（ES细胞），还有不规则的（细胞（丝裂霉素处理的MEF细胞，分化细胞） ；纯化以后 基本都是圆形细胞（ES细胞） , D! J& u& b7 P
   #   差速贴壁用的 培养皿也需要用0.1%明胶处理。- B" h- [1 ~' p
& c, S# q. B& j1 O, K
                           以上也是结合资料和论坛取经的结果 ，本实验室里从事ES/iPS 细胞工作的只有两人，都是半路出家 的 。属于闭门造车。不知道 大家有什么意见。

chiangmax

- L8 O% O" W2 p

听说feeder经丝裂霉素处理后，活不了多久，那么如果要对ES进行传代的话，还需要重新制作feeder吗？另外，酶 ...
4 F) G% _0 C) E2 Pzhaoyan1983 发表于 2010-9-22 00:03

. X& i0 L6 i$ o+ f: K" F一、传代前需要铺新的FEEDER;
* ~: i- g& A" C3 j" Z0 E二、传代时上一代的ES细胞里混杂的FEEDER不影响ES的生长，因为FEEDER是不会增殖的；
9 {: F2 g/ D* G9 |) s2 L& V! ^三、而且如果需要纯化，必需用FEEDER FREE系统培养2-3代以上，才可以基本上除去FEEDER

xiaoserizi

受教了

maozhuxiwo1

丝裂霉素处理对MEF影响很大，建议事先做个对比试验。
. _  G# c, B# L 比如可以选择 丝裂霉素作用2h 2.5 3h 3.5h 后，种在6孔板，观察MEF形态。