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作者：柯春龙 陈白莉 郭少雷 黄正松作者单位：中山大学附属第一医院神经外科，广东 广州 510080 : }3 c+ Y: r& {) W' s) C$ Y a* F9 E
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【摘要】 目的 探讨三七总皂甙对神经干细胞体外诱导分化多巴胺能神经元移植帕金森病(PD)大鼠后移植细胞的存活及移植疗效的影响。方法 大鼠胚胎中脑神经干细胞经传代扩增后，在分化液中诱导向多巴胺能神经元分化，应用6羟基多巴胺制备的PD大鼠模型随机分为多巴胺能神经元组、多巴胺能神经元 三七总皂甙组、三七总皂甙组及手术对照组，每组8只，进行移植手术，移植后检测PD大鼠不对称旋转行为的变化及纹状体移植区酪氨酸羟化酶染色阳性细胞存活的情况。结果 与手术对照组比较，移植后20 d多巴胺能神经元组大鼠不对称旋转圈数开始明显下降（P＜0.01）。移植后10～60 d，多巴胺能神经元 三七总皂甙组大鼠的不对称旋转圈数明显低于多巴胺能神经元组（P＜0.01）。免疫组织化学染色显示多巴胺能神经元 三七总皂甙组大鼠纹状体移植区酪氨酸羟化酶染色阳性细胞数明显多于多巴胺能神经元组（P＜0.01）。结论 三七总皂甙具有提高神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植PD大鼠后移植细胞的存活率及移植疗效的作用。 5 N) u* j7 k( q5 y$ B
【关键词】三七总皂甙 神经干细胞 多巴胺能神经元 帕金森病
; m6 Q( T5 v1 _& R4 a 通过筛选不同细胞因子的诱导分化作用发现，白细胞介素1、白细胞介素11、胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子配伍可明显诱导大鼠中脑神经干细胞定向分化成多巴胺能神经元〔1，2〕。Carvey等〔3〕应用神经干细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病(PD)大鼠，手术取得一定的疗效，但移植细胞存活率仍较低。三七总皂甙（PNS）含人参皂甙Rb1、人参皂甙Rg1、人参皂甙R1，具有很强的抗氧自由基和抗脂质过氧化作用，目前已广泛应用于心脑血管疾病的治疗。因此，本实验拟将PNS应用于神经干细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗PD大鼠，观察其对移植细胞的存活及移植疗效的影响，为提高PD移植手术的疗效寻找新的途径。
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1材料与方法( T$ x( t+ t4 _3 G; ~; M) C
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1.1动物6 X/ T: p- ^( e
& ]" n6 g% J% r* Y 健康的成年雄性SD大鼠，体重220～260 g；孕14～15 d的健康SD大鼠；均由中山大学动物实验中心提供。
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1.2方法
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1.2.1试剂
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DMEM/F12培养液、B27添加剂、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10%胎牛血清均购自美国Gibco公司；0.1%多聚赖氨酸、10%小牛血清、6羟基多巴胺、阿朴吗啡，均购自Sigma公司；白细胞介素1α（IL1α），白细胞介素11（IL11）、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，均购自 R&D公司；白血病抑制因子(LIF)购自 PEPROTECH公司；酪氨酸羟化酶抗体购自Santa Cruz公司；巢蛋白抗体、微管相关蛋白2抗体、胶质纤维酸性蛋白抗体，均购自CHEMICON公司；PNS购自云南云科药业有限公司。
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1.2.2PD大鼠模型的制备
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% h9 c7 h+ y8 @7 r 选择健康成年雄性SD大鼠，以10%水合氯醛(3～4 ml/kg)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定向仪上，按Sauer〔4〕和Lee等〔5〕的方法，确定大鼠右侧中脑被盖腹侧区的注射座标为：前囟后5.0 mm，中线右侧旁开1.6 mm，硬膜下7.5 mm。颅骨钻孔暴露硬脑膜后，经微量注射器向该点注入5 μl（6 μg/μl）6羟基多巴胺。术后3、4 w腹腔注射阿朴吗啡（0.5 mg/kg），诱发大鼠向健侧的单向旋转行为，计数30 min，以两次旋转圈数均＞7次/min的大鼠作为成功PD大鼠模型，两次旋转圈数求平均值，作为移植前的旋转圈数。
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1.2.3神经干细胞的分离、培养、传代及诱导向多巴胺能神经元分化. \+ ]. F K1 {. x( `
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将孕14～15 d的SD大鼠脱颈处死，无菌条件下剖腹取出胚胎，解剖显微镜下分离中脑腹侧脑组织，加入2.5 g/L胰蛋白酶室温消化20 min，离心弃上清后加入含B27（20 g/L）、EGF（20 μg/L）、bFGF（20 μg/L）、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM/F12无血清培养液，玻璃吸管轻柔吹打分散细胞，100目滤网过滤制成单细胞悬液。台盼蓝染色活细胞计数，调整细胞浓度为5108个/L，接种入25 ml培养瓶内，每瓶量约5 ml。培养瓶置入CO2恒温培养箱(5%CO2、95%O2、37℃)内培养。每3～4 d半量换液1次，7～10 d传代1次。神经干细胞诱导向多巴胺能神经元分化及其免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测见参考文献〔6〕。
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1.2.4移植手术
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. O+ H0 A! J/ I2 ~% ~ Z PD大鼠随机分为多巴胺能神经元组、多巴胺能神经元 PNS组、PNS组及手术对照组，每组各8只，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定向仪上，采用两点移植法，定位于大鼠毁损同侧纹状体的座标为：第一点：前囟前1.0 mm，中线右侧旁开2.5 mm，硬膜下5.0 mm；第二点：前囟前0 mm，中线右侧旁开3.0 mm，硬膜下6.0 mm。颅骨钻孔暴露硬脑膜后，经微量注射器向坐标点注入移植物。多巴胺能神经元组向每一坐标点注入3 μl（1105个/μl)神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元细胞悬液；多巴胺能神经元 PNS组注入3 μl（1105个/μl)含有PNS（250 mg/L）的神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元细胞悬液；PNS组注入3 μl PNS（250 mg/L）；手术对照组注入3 μl DMEM/F12细胞培养液，注射速度为1 μl/min，留置空针10 min后退出，缝合头部皮肤，常规喂养。移植术后10、20、40、60 d分别给予大鼠腹腔注射阿朴吗啡（0.5 mg/kg），诱发大鼠向健侧的单向旋转行为，计数30 min，以圈数/min表示。
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1 e, d0 z; N# Z) ` 1.2.5纹状体移植区酪氨酸羟化酶免疫组织化学检测
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移植术后60 d的大鼠灌注固定后取脑，移植部位连续冰冻切片并编号，片厚5 μm，间隔20 μm。冰冻切片吹干后，在30 g/L H2O2中室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗3次。0.3% TritonX100溶液室温孵育20 min，0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液冲洗3次。滴加5%小牛血清封闭液，室温30 min。滴加一抗（兔抗大鼠酪氨酸羟化酶抗体），4℃过夜，0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液冲洗3次。滴加生物素化二抗（山羊抗兔免役球蛋白），37℃ 20 min，0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液冲洗3次。即用型链霉亲和素生物素过氧化氢酶复合物法显色系统显色。400倍显微镜下观察及摄片，采用定量病理学方法分析结果。; L" S& a8 X) W/ q$ k. k
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1.3统计学分析. C. ?7 x( A! J9 \: w3 s' K% G' {
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实验数据均以x±s表示，应用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析。3 a$ a% m0 s3 w3 W; g8 w/ J' v
! o; W" i% M, {9 x4 d6 \ 2结果
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7 {- X4 @- R$ y3 w7 U/ m- c 2.1神经干细胞的体外培养及诱导分化
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神经干细胞在无血清培养液中形成大小不等的悬浮神经球。神经球细胞巢蛋白染色呈强阳性，证实其具有神经干细胞的特异性标志。在诱导分化液中神经干细胞球贴壁生长，球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出形态各异的细胞，免疫细胞化学染色显示分化细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞，流式细胞仪检测诱导分化6 d的细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率为(17.8±4.2)%。
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) n. v( j: r3 ^" g; m& A0 v3 P 2.2PD大鼠移植后旋转行为的变化0 K% t5 }0 s, i9 D+ z) I, ~" J& `. h2 c
r$ z- x. Z" v$ F. Z& P PNS组及手术对照组大鼠移植前后不对称旋转行为无明显变化（P＜0.01）。与手术对照组比较，移植后10 d多巴胺能神经元 PNS组大鼠不对称旋转行为即有显著性改善（P＜0.01）；移植后20 d多巴胺能神经元组大鼠不对称旋转圈数开始明显下降（P＜0.01）。移植后10 d开始，多巴胺能神经元 PNS组大鼠的不对称旋转圈数明显低于多巴胺能神经元组（P＜0.01）。见表1。& Z3 ?. r3 I, w: v
. F# ]$ a' `! X$ q$ o b 2.3移植区酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的检测" v5 {( w& y# A% v$ k+ \. s* T
: b5 W" j/ K2 V5 k4 y$ R 多巴胺能神经元组和多巴胺能神经元 PNS组大鼠纹状体移植区均可见到酪氨酸羟化酶染色阳性细胞，多数细胞位于移植针道边缘。PNS组及手术对照组未见酪氨酸羟化酶染色阳性细胞。细胞计数显示多巴胺能神经元 PNS组酪氨酸羟化酶染色阳性细胞数为(732±82.6)个/400倍视野，明显多于多巴胺能神经元组的（326±34.8）个/400倍视野（P＜0.01）。表1各组大鼠移植后旋转行为的变化（略）! F9 o. r, |' f7 `9 a
3 M8 _! p f1 c% r9 |1 I 3讨论
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' L) H2 y/ e* T( j+ t1 ^4 L! b PD是中老年人常见的中枢神经系统变性疾病，65岁以上的老人发病率达1%。其基本病理改变是黑质多巴胺能神经元发生退行性变，使接受黑质多巴胺能神经元投射的纹状体多巴胺含量明显下降或纹状体受体退变。Studer〔7〕及其合作者从胚胎大鼠中脑获得神经干细胞，在体外经bFGF扩增后，在移植前撤除生长因子，使神经干细胞转化为多巴胺能神经元，植入多巴胺耗竭的成年大鼠纹状体后80 d，其不对称旋转下降有统计学意义（平均下降75%），首次提出神经干细胞在体外诱导分化为多巴胺能神经元后移植治疗PD大鼠的有效性。目前多巴胺能神经元移植治疗PD仍面临细胞存活率低的问题，大部分细胞发生程序性死亡，即凋亡〔8，9〕。
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本实验成功从胚胎大鼠中脑腹侧脑组织中分离、培养神经干细胞及进行传代扩增，并且在体外定向诱导并向多巴胺能神经元分化，流式细胞仪检测其诱导分化成多巴胺能神经元的比率达到(17.8±4.2)%，从而为移植治疗PD大鼠提供了充足的细胞来源。本研究证实体外诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠具有一定疗效，但该作用尚不能恢复帕金森病大鼠的正常功能。移植后10～60 d，PNS干预的多巴胺能神经元组大鼠的不对称旋转圈数明显低于神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元组，而纹状体移植区存活的多巴胺能神经元细胞数亦高于神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植组，显示PNS具有提高神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植PD大鼠手术疗效的作用，其作用与提高移植区多巴胺能神经元的存活率相关。
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在多巴胺能神经元移植治疗PD的研究中，细胞机械损伤、胰酶消化、移植后缺血缺氧等是导致移植后多巴胺能神经元凋亡的主要因素，这些因素引起细胞内钙离子超载及氧自由基形成，氧自由基通过攻击细胞膜的不饱和脂肪酸，导致脂质过氧化反应，从而激活凋亡相关基因，诱导细胞的凋亡。PNS是三七的主要成分，与三七生药相比，药效更为突出。研究发现，PNS具有阻断细胞外钙离子内流，抗氧自由基，抗脂质过氧化，抑制血小板聚集及改善微循环的作用，进一步研究还发现PNS通过清除参与凋亡信号转导的活性氧自由体，降低缺血组织中一氧化氮，下调促凋亡基因cfos的表达及增强抗凋亡基因bcl2和热休克蛋白70的表达，阻断细胞凋亡的过程，并减少因组织缺血缺氧引起的细胞凋亡〔10〕。本研究中，PNS干预的多巴胺能神经元移植PD大鼠后移植细胞存活率明显增高，显示PNS具有抗细胞凋亡从而保护移植区多巴胺能神经元的作用，其具体作用机制仍有待进一步研究。
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发表于 2009-3-3 12:24
发表于 2015-5-24 20:35
