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作者：姜敏辉，王卫彪，曹京燕作者单位：南通大学附属医院心血管内科， 南通226001 ; p5 @3 j9 @% r7 g( u
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【摘要】 目的:探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植对兔心肌梗死（myoeardial infarction，MI）的治疗作用。方法:大耳白兔38只，2只用于提供MSCs，余36只随机分为对照组、MI组和MSCs移植组。采用结扎左冠状动脉前降支方法制作MI模型，在MI 后1小时将DAPI标记的MSCs移植至梗死区, 对照组注射等量PBS。术前、术后2周、4周分别做超声心动图检查其心功能变化。术后4周处死兔，取心梗区组织进行组织学观察。结果: 心梗4周后，MSCs组心肌组织冷冻切片中可以观察到DAPI标记细胞存在。MSCs组心功能和毛细血管密度与MI组比较差异均有统计学意义（P
2 x; f o& s4 o( w3 V8 O8 ^ 【关键词】心肌梗死 骨髓间充质干细胞 移植 兔
" j- h! l+ R- w3 q$ R' o An experimental study of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation to treat myocardial infarction in rabbits
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* W* M& N5 o' y" s9 C: `- @ JIANG Minhui, WANG Weibiao, CAO Jingyan（Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001）, b" e, }' w; m/ ]8 G
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[Abstract]Objective: To investigate the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) transplantation on the therapy of myocardial infarction (MI) in rabbits. Methods: 36 rabbits were randomly divided into three groups: the control group, the MI group, the MSCs group. MI was induced by ligation of left anterior descending branch of the coronary artery. The MSCs labeled by DAPI were transplanted after MI 1 h. Echocardiography was performed to evaluate the cardiac function before operation and 2 weeks and 4 weeks after MI. After four weeks, specimens were harvested from the transplanted areas and observed histologically. Results: Four weeks after AMI, the labeled cells were viable in the recipient heart. In contrast with the MI group, the heart function and vascular density of the MSCs group had significant difference（P
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% W( F% N, w4 Z& `$ @# f [Key words]Myocardial infarction；Mesenchymal stem cell；Transplantation；Rabbit
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2 v$ S. y9 {% S 心肌梗死后心衰的根本原因在于心肌细胞的数量减少。细胞心肌成形术是近年来发展起来的一项有广泛应用前景的治疗方法，目前有许多学者致力于此方面的研究[1]。骨髓MSCs是一种多潜能分化干细胞,能分化成心肌细胞[2]，由于取材方便，来自自体，无排斥反应、无伦理问题、扩增能力强等优点，是目前细胞移植较理想的靶细胞。本实验拟探讨骨髓MSCs移植治疗兔MI的疗效及其机制。; s' g! |8 `1 j" N% b( W
( H# `1 f3 a& Q8 A+ P 1材料与方法
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( y* V( [' _& {# `, J9 g$ Z. B2 n, g 1.1试剂DMEM-LG培养基(Gibco公司)；胎牛血清（Gibco公司）；percoll细胞分离液（密度为1.077 g/ml，Pharmacia公司）；5-氮胞苷(5-azacytidine，5-aza）（Sigma公司)；DAPI(Roche公司);彩色B超机SEQUIA512，超声频率7.0 MHz；透射电子显微镜（日本JEOL公司，JEM-1230型）等。
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9 B$ W2 e6 P' G3 u3 |) {& h% d 1.2动物及分组大耳白兔38只，体重2.0～2.5 kg，由南通大学实验动物中心提供。2只用于提供MSCs，余36只随机分为3组，每组10只；（1）对照组冠状动脉下穿线，不结扎，心肌内注射PBS液；（2）心肌梗死组（MI组）制成MI模型，心肌内注射等量PBS液；（3）MSCs移植组（MSCs组）制成MI模型，心肌内注射等量含MSCs的PBS液。
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* |7 ~/ C. _3 a4 Z2 `9 Z- X3 [0 R 1.3方法
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1.3.1兔MSCs的分离及培养无菌条件下进行兔髂后上棘穿刺抽取骨髓,加肝素抗凝。应用percoll细胞分离液离心提取MSCs，用含10%胎牛血清的DMEM-LG进行培养。37 ℃、5%CO2条件下培养，2天后首次换液，贴壁细胞达到约80%融合时用胰蛋白酶消化，按1∶2进行传代培养。通过不断的换液及传代纯化扩增MSCs。P3用流式细胞仪检测鉴定。+ t2 K& \. V* V2 a
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1.3.2MSCs的诱导分化及鉴定P3第4天用10 μmol/L 5-aza进行诱导24小时，再用原培养基继续培养4周，期间酌情延迟换液，不予传代。4周后，通过RT-PCR检测5-aza诱导4周和未诱导MSCs的β-MHC、cTnI的表达。将诱导4周的MSCs用4%戊二醛固定后，送至电镜室检测。
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3 Q _- D: v8 N- h4 b7 o# ^ 1.3.3兔MI模型的建立及细胞移植采用开胸结扎前降支的方法建立MI模型，以左室前壁心肌变苍白和心电图胸前导联出现ST段抬高为成功标志。MI后采用心肌外膜直接注射法进行MSCs移植。术后3天肌注青霉素G抗感染。
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1.3.4左心功能测定在术前、术后2周、4周后分别进行超声心动图检查。麻醉状态下，经左侧胸壁，2D超声在左心室长轴、短轴切面观察室壁运动情况。在长轴切面左心室乳头肌水平，M超声测量乳头肌水平左心室舒张末内径及左心室收缩末内径，以机器内置的Teich公式计算左心室射血分数(LVEF)。
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4 a5 F3 X8 w4 e* \% d8 L5 X& N- A' L6 a9 z 1.3.5切片和观察术后4周，用10%氯化钾沿耳缘静脉处死兔，取出心脏；（1）将梗死边缘区制成4 μm厚的快速冰冻切片，在荧光显微镜下观察是否有带蓝色荧光的供体细胞，了解移植细胞是否能在心肌中存活与分布；（2）电镜观察梗死边缘区心肌；（3）HE染色，光学显微镜下观察。 Q8 Z! i' P* E+ T8 E7 R) U; y
* {# d# H \- H& H! n 1.3.6统计学方法计量资料用x±s表示，运用Stata/SE 10.0统计软件进行分析。计量资料以x±s表示进行F检验，两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。. ]) }0 y+ M+ z Y
0 M! e& `+ P! T& Z1 Q 2结果
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2.1骨髓MSCs的培养及鉴定MSCs接种24小时后，显微镜下可见到大量红细胞悬浮在培养液中，少量细胞贴壁，呈梭形。48小时后，部分细胞伸出伪足变成纺锤形。6天后可见部分细胞开始分裂，以集落式迅速生长，呈旋涡状或放射状(图1)。以后集落数目逐渐增多，12~15天集落相互融合，细胞单层生长并铺满整个培养瓶底(图2)。传代后细胞分布均匀，增值速度加快，约5~7天长满瓶底，且排列整齐有序。流式细胞术分析结果显示细胞均一性好，P3均一性在97％以上。细胞表面抗原CD34、CD45、CD11b阴性，CD90、CD29阳性，提示MSCs为区别于造血干细胞的骨髓非造血类细胞。
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2.25-aza诱导后细胞形态变长，体积增大，诱导后培养第7天，光镜下细胞增大明显，排列方向一致，之后细胞增殖速度减慢，部分细胞脱壁死亡。2~3周细胞数量较同期未经诱导组明显减少，体积大小不等，形态多样，胞浆粗糙（图3）。9 g0 ?4 ~" J( M
: `9 b1 B% |7 o4 U) a 2.3RT-PCR结果发现5-aza诱导4周后的心肌样细胞中构成肌球蛋白重要成分的β-MHC和cTnI有阳性表达，未诱导的MSCs表达均为阴性。
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2.4各组动物心脏超声变化超声心动图检查发现，MI组术后左室腔增大，前间隔、前壁变薄，活动减弱，内回声增强，部分可见血栓形成。MSCs组表现相似，但比MI组轻。超声心动图测定结果见表1。
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: a5 E' H5 q2 X4 H2 `! g 2.5DAPI标记的MSCs体内鉴定在荧光显微镜下MSCs组心肌梗死中心区和边缘带可见DAPI标记的细胞。这些细胞呈簇状、条索状或散在分布。阴性对照和MI组未见DAPI标记的细胞 (图5)。0 ?9 j4 s0 v9 d2 y0 K) ~* [( u# @* j% o
, r* Q. P+ v( A* o 2.6超微结构改变MSCs组可见幼稚的细胞：胞核大，染色质颗粒细而均匀，以常染色质为主，核周有线粒体、核糖体，可见由肌微丝刚形成的小肌原节和发育程度不同的肌原纤维，考虑为移植的MSCs细胞分化而来，周围有较多的毛细血管，部分可见与周围正常心肌形成缝隙连接(图6)。
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2.7苏木素-伊红染色左室心肌组织切片HE染色可见坏死灶，心肌细胞溶解坏死，炎症细胞和成纤维细胞增生。毛细血管密度在梗死边缘区和中心区MSCs移植组（19.30±2.43、7.34±2.63个/400倍视野）均明显高于MI组（16.03±2.86、4.76±1.98个/400倍视野），差异有统计学意义（P+ n8 c9 k& {1 ~* v
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4 E4 t' [5 e* p+ H! f MSCs不仅具有自我更新、多向分化的潜能，而且具有低免疫原性的细胞表面表型特征，并可抑制T细胞的增殖和记忆性T细胞对它们抗原的反应[3,4]，为它的临床应用的安全性和有效性提供了可靠的理论依据。本实验中,在兔MI模型基础上建立了同种异体MSCs移植治疗MI实验模型，这是一个类似临床的供体细胞可以提前筛选和准备，以便在患者需要时可以立即使用。我们成功地进行了在急性期MI进行心肌内注射移植MSCs,移植细胞能成功地植入并存活4周，未见明显的超急性期和急性期移植排斥反应，近期观察这一方法是安全可靠的。9 j' m, B3 ]( _2 T9 T0 B
* J+ m( ?' ?, m$ C2 M2 h 本试验第3代MSCs经5-aza处理后电镜超微结构、分子生物学表现类似心肌细胞。此外,Hakuno等[5]还发现经5-aza诱导的MSCs可表达肾上腺能和毒蕈碱受体，并能介导信号传导。骨髓中MSCs含量很少，占细胞总数的10-5～10-4，故体外纯化和扩增是进行移植研究的先决条件。MSCs的贴壁生长性使其分离和纯化简单易行。MSCs作为多能干细胞向心肌细胞分化的调控机制目前尚不明确。5-aza是一种去甲基化药物，推测其诱导MSCs心肌细胞化的作用与特定调控基因上阻遏蛋白的去甲基化有关[6]。0 ^6 |" d+ I/ l0 L, ^+ A
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在本实验MSCs组荧光显微镜和电镜结果显示,在梗死区及其周边有DAPI标记的类似幼稚样心肌细胞存在，Wakitanai等(1995)的研究证实骨髓干细胞含有肌原性祖细胞，可成为肌细胞的来源，而且由于成熟心肌细胞不能再生，所以可以断定这些幼稚的心肌细胞是移植的骨髓干细胞分化而来。这种形态上的差异可能与3种因素有关：骨髓干细胞在移植前就是一个处于不同分化状态干细胞的混合体；移植区微环境差异；观察时间不足。即使移植细胞分化程度幼稚，但在防止急性心肌梗死后左心室扩大，心室前壁变薄以及将来的心室重构起了积极的作用。统计学结果也进一步证实了这一点，MSCs组对心脏功能的改善较MI组明显,能明显使室壁变厚, EF值增加，室壁运动幅度加大，由此可见细胞移植对心脏收缩和舒张功能均有改善。
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本研究结果表明，经5-aza诱导的MSCs同种异体移植入兔MI模型的受损心肌后能存活并改善宿主心功能，从而为临床应用提供了实验依据。
j3 m: E0 w: b: O0 C 【参考文献】! R2 C3 A4 ~: ^0 Z
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发表于 2009-3-3 12:25
发表于 2015-6-12 18:08
