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作者：暴丽华作者单位：山东大学医学院解剖学教研室， 山东 济南 250012
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【摘要】 目的：探讨血清对联合培养神经上皮干细胞与Schwann细胞的影响，进一步寻求诱导神经上皮干细胞定向分化的影响因素。方法：采用不同浓度血清联合培养神经上皮干细胞与Schwann细胞，收集上清液作为条件培养液，免疫细胞化学染色观察条件培养液诱导神经上皮干细胞分化，统计分析分化为神经元与星形胶质细胞的比例；MTT检测条件培养液促Schwann细胞存活及增殖的作用。结果：Schwann细胞促进神经上皮干细胞存活和分化，随着血清浓度增加，神经上皮干细胞分化形成的神经元比例减少；神经上皮干细胞及血清均促进Schwann细胞存活和增殖，随血清浓度增加，存活及增殖率增加。结论：无血清或较低血清浓度有利于共培养的Schwann细胞存活和增殖，同时也有利于共培养神经上皮干细胞存活和向神经元方向分化。
: Y6 `4 ~- n# y5 ?. T0 E6 i 【关键词】干细胞 神经上皮 分化 雪旺细胞* w4 E. ?" }) p4 N
［ABSTRACT］Objective: To explore the influence of serum of different concentrations towards cocultured neuroepithelial stem cells and Schwann cells, and further to seek the factors inducing the orientation differentiation of neural stem cells. Methods: The supernatant was collected as a conditional medium from a flask ofcoculturing neuroepithelia stem cells and Schwann cells in serums of different concentrations. The neurons and the astroglia cells differentiated from the neuroepithelial stem cells induced by the conditional medium were counted by the immunocytochemistry technique and the soft IPP. The survival and the proliferation of the Schwann cells were determined by MTT. Results: The Schwann cells promoted the survival and differentiation of neuroepithelial stem cells, and the number of the neurons decreased with an increase of serum concentration. Both the neuroepithelial stem cells and serum promoted the survival and the proliferation of the Schwann cells. Conclusion: Serum of free or lower concentration is favorable forSchwann cell survival and proliferation and it is advantageous to the survival and differentiation of neuroepithelial stem cells into neurons.
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［KEY WORDS］Stem cells; Neuroepithelium; Differentiation; Schwann cells构成胚胎早期神经管壁的神经上皮干细胞(neuroepithelial stem stem cells,NSCs)，是具有自我复制能力和多向分化潜能的神经干细胞，具有移植后存活率高，迁移能力强，分化形成的神经元较多，以 及被髓鞘化和形成传入传出突触结构［1］等特点。雪旺细胞(Schwann cells，SCs)为周围神经胶质细胞,可分泌多种神经营养因子、细胞外基质及细胞粘附因子,促进损伤的周围及中枢神经系统再生，也能促进神经干细胞存活及分化［2］。血清中含有多种营养物质及生长因子，不仅能促进Schwann细胞存活和增殖，还可在体外诱导神经干细胞分化［3］。本实验则表明无血清或低浓度血清联合培养神经上皮干细胞和Schwann细胞，有利于Schwann细胞存活和增殖，也有利于Schwann细胞诱导神经上皮干细胞存活和向神经元方向分化。神经干细胞体内体外分化机制尚未完全明确，探索诱导神经干细胞分化的条件和机制, 将为神经干细胞移植或联合移植应用于治疗神经系统疾病提供理论支持。% o1 z1 q: A N1 ^! n6 z5 |, J7 E9 ?
1 y, {0 j) ?1 `, L+ o1材料与方法
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5 k" X' s7 r' \$ {1.1材料孕11.5?d Wistar大鼠及出生4 6?d内的Wistar新生大鼠，由山东大学实验动物中心提供；DMEM/F12(1∶1)、B27、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰蛋白酶均为美国Gibico公司产品；胶原酶IV、多聚赖氨酸、四甲基偶氮唑蓝（MTT）均为美国Sigma公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；倒置相差显微镜，荧光显微镜，Olympus DP70为日本Olympus公司产品；Multiskan MK3 酶标仪为芬兰Labsystems公司产品；兔抗人抗巢蛋白(nestin)单抗、小鼠抗微管相关蛋白2（MAP2）、小鼠抗大鼠S100单抗 neomarker；兔抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、FITC标记抗兔IgG、TRITC标记抗兔IgG、TRITC标记抗小鼠IgG、生物素化马抗小鼠IgG、辣根酶标记链亲和素、DAB均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。4 @- h& J: v7 B- M' l8 g: X2 @
4 s) u2 Z' h. b, ^6 P9 O, j6 b q) t1.2胚胎神经管上皮干细胞取材及培养无菌条件下取出孕11.5?d（E11.5?d）大鼠胚胎,解剖显微镜下分离神经管，将分离出的神经管组织移入离心管中，用吸管反复吹打至组织块消失，800?r/min离心5?min，弃上清，加入含10?ng/ml bFGF和1B27的DMEM/F12(1∶1），以105 106个/ml接种,视细胞的生长情况，隔日加生长因子或每3?d半量换液。3 5?d后悬浮生长的细胞形成神经球，机械分离神经球，传代。取第2代神经球悬液移种到24孔板中,孔中预先置入用0.01%多聚赖氨酸包被的盖玻片。加少量含10%血清的DMEM/F12(1∶1）培养基, 约3?h后神经细胞球贴壁即可进行免疫荧光化学染色。% r) U! V, l: g$ M! z( M
# k Y8 W4 K( _6 w5 i/ O* Q1.3Wistar新生大鼠Schwann细胞培养无菌条件下剥离新生4 6?d Wistar大鼠的双侧坐骨神经及臂丛神经，置于无菌Dhanks液中，解剖显微镜下剥除神经外膜及神经束膜，加入终浓度0.125%的胰蛋白酶和0.03%胶原酶IV，快速剪碎神经组织约1?mm3，37?℃水浴震荡消化15 20?min，用吸管吹打组织至肉眼消失，加入等体积10%血清的DMEM/F12(1∶1）培养液终止消化，800 1?000?r/min离心8 10?min，Dhanks液重悬细胞，800 1?000?r/min离心8 10?min，弃上清，10%血清的DMEM/F12(1∶1）接种于预涂有多聚赖氨酸的培养瓶中，5%CO2, 37?℃、饱和湿度培养，每3?d换新培养液，6 10?d传代纯化，取第2代Schwann细胞，S100免疫细胞化学鉴定。
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1.4条件培养液收集及实验分组参考张蕾等［4］方法，Schwann细胞与神经上皮干细胞联合培养，培养液分别为无血清的DMEM/F12(1∶1），1%血清的DMEM/F12(1∶1），5%血清的DMEM/F12(1∶1)，10%血清的DMEM/F12(1∶1），每2?d更换新鲜培养液，并分别将收集更换的上清液过滤即为条件培养液，-70?℃保存。实验组培养液分别为收集到的0、1、5、10%血清条件培养液；对照组为0、1、5、10%血清DMEM/F12(1∶1）培养液。
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1.5MTT检测Schwann细胞存活及增殖传代纯化后的Schwann细胞以105个/ml接种于多聚赖氨酸包被过的96孔板中，每孔100?μl，按1.4分组，各组均设8个复孔，培养3?d后，每孔加入MTT溶液（5?mg/ml）15?μl，继续培养4?h后吸掉上清，每孔加入100?μl DMSO溶解结晶。然后将培养板放在Multiskan MK3酶标仪上，采用实验波长570?nm，测定每孔OD值。5 c) e3 q8 E/ Y4 Z9 f
. {1 p! w- o) z) _8 w, m% C1.6免疫荧光染色检测神经上皮干细胞的分化神经上皮干细胞接种于置有预涂多聚赖氨酸的盖玻片的24孔板中，每2 3?d换液，培养1周，取出盖玻片，固定，免疫荧光染色，荧光纤维镜下每组随机选取4张盖玻片，每片随机取5个不同的视野，计数同一视野中神经元及星形胶质细胞，统计各组神经元及星形胶质细胞的比例。# u% L: k% G7 ?. U5 H# |4 u
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1.7免疫荧光化学染色取出待染细胞的盖玻片, PBS漂洗3次，每次5?min, 4%多聚甲醛室温固定30?min,PBS洗3次,0.5% Triton X100孵育15?min，PBS洗3次，每次3?min，正常马血清封闭非特异性反应,不洗，加一抗分别为抗Nestin IgG、抗MAP2 IgG、抗GFAP IgG。4?℃过夜, 次日加入PBS 冲洗3次，每次5?min，除去PBS，加入相对应的荧光二抗，37?℃孵育30?min，PBS震荡冲洗4次，每次5?min，除去PBS，甘油-碳酸盐缓冲液封片。阴性对照用PBS代替一抗。荧光显微镜观察。( @7 ?9 O0 {5 S
" b' p. z, `9 G' t" f1.8统计学处理实验数据应用SAS 8.0软件进行统计分析，多个样本均数差异的显著性检验应用方差分析，两样本均数差异的显著性检验应用t检验。
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% I7 e* `" \$ z! }2结果& A. N1 X0 }+ m; N
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2.1神经上皮干细胞培养观察及鉴定非神经干细胞贴壁生长，逐渐死亡，神经上皮干细胞悬浮生长并分裂增殖，形成十几个细胞组成的小神经球，随着培养时间的延长，神经球中细胞数目不断增加，第5 6?d可生长成大约几十个甚至上百个细胞组成的神经球。由于这些细胞具有聚群生长的特点，接种浓度越高，相邻神经球越容易融合。球体nestin染色阳性，诱导分化后MAP2、GFAP染色阳性细胞（见图1、2、3），星形胶质细胞较多，胞体呈不规则形，有多个突起；神经元少，胞体较饱满，突起细长。
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' {8 S# B9 {: F+ e2 D2.2Schwann细胞培养及鉴定刚接种的原代Schwann细胞呈圆形，悬浮在培养液中，接种后6?h大部分细胞贴壁，其中大部分细胞开始呈椭圆形，24?h后变成双极，胞体饱满，立体感强，少数呈三角形，伸出三个突起。培养48 72?h后，出现聚合现象，许多细胞聚合在一起呈端对端、肩并肩、漩涡状或栅栏状排列，在细胞密度较低时，则聚集成堆，形成“细胞岛”。免疫细胞化学染色显示80%以上的细胞S100呈阳性反应（见图4）。# \. K; f( O: Q( V+ o7 G, c* ^
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2.3条件培养液对Schwann细胞存活及增殖的影响见表1。MTT实验结果显示:实验组及对照组中随血清浓度提高，Schwann细胞存活及增殖率显著增加；0%血清实验组较0%血清对照组更能促进Schwann细胞存活和增殖，而其余血清浓度对照组促存活增殖效果优于实验组（P＜0.01）。 V6 ^) z% @; l% v
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, K: }( n6 Z+ f+ ^, w( j; e神经上皮干细胞不仅能够分化形成中枢及周围神经系统的主要细胞，还有着巨大的神经元方向分化潜能，使其更适合修复损伤的神经通路［5］。Schwann细胞促进神经干细胞向神经元方向分化，而血清对Schwann细胞存活增殖以及神经干细胞存活分化均有影响。% _7 K& f* H2 Q8 O2 Q
, ]$ P/ `6 l6 f% ?3 p" C, v' M! g5 F本实验采用不同浓度血清条件下联合培养神经上皮干细胞和Schwann细胞的上清液作为条件培养液，分别培养神经上皮干细胞和Schwann细胞，模拟联合培养体系，方便观察该体系中神经上皮干细胞和Schwann细胞的变化。本研究结果表明，不同浓度血清的条件培养液诱导神经上皮干细胞分化，发现无血清的条件培养液能支持神经上皮干细胞的生长并诱导其分化，与万虹等［6］研究Schwann细胞支持胚胎神经干细胞的生长并诱导其分化结果一致，可能与条件培养液中含有Schwann细胞分泌NGF、BDNF、CNTF、bFGF等诸多神经营养因子有关；不同血清浓度的条件培养液对神经上皮干细胞的诱导分化作用不同，随着血清浓度增高，星形胶质细胞逐渐增多，这与刘缘等［7］人的实验结果一致。本实验中选用神经上皮干细胞在体外经含有碱性成纤维细胞生长因子bFGF的神经干细胞培养液纯化，无血清的联合培养基作用下神经元与星形胶质细胞比例可达到1.5∶1，但是随着培养液中血清浓度增加，该比例仍逐渐减小。+ l- M7 v7 @: f& W6 @6 `2 ?+ s
0 ^# s5 ~. E' p* z# v, a# j, }) y本研究还显示条件培养液能够促进Schwann细胞存活和增殖，表明联合培养对Schwann细胞存活和增殖有支持作用。尽管Schwann细胞能够促进神经干细胞向神经元方向分化，且神经上皮干细胞尤其在体外经含bFGF培养液培养后，更多倾向于神经元方向分化，但是血清的作用仍不可忽视。有报道Schwann细胞诱导神经干细胞分化与开启神经干细胞向神经元方向分化的相关基因有关，去除Schwann细胞的影响后，神经干细胞仍向神经元分化，本实验用含不同浓度血清的条件培养液培养发现分化的神经元比例不同，推断血清影响Schwann细胞的某些因子的作用，也有可能与血清条件下GFAP阳性的神经胶质细胞增值有关。星形胶质细胞作为脑内最多的胶质细胞，给神经元提供营养及代谢支持，并调整突触的效能［8］，所以在神经通路功能修复中探讨神经干细胞分化为神经元的同时，也不可忽略星形胶质细胞在体内外对神经元的有益作用。本实验显示Schwann细胞在促进神经上皮干细胞存活及分化的同时，神经上皮干细胞也促进了Schwann细胞的存活和增殖。血清能够促进Schwann细胞存活和增殖，但同时影响神经上皮干细胞神经元方向的分化。' ~' p. {7 ?3 ]1 z9 p
: Z5 _6 Q7 a. ~8 Z, O& ^; Z7 ~神经干细胞在体内的分化是通过细胞内、外众多成分相互作用起效应的［9］，不仅受血清影响，还有其他多种细胞因子及细胞间连接影响。因此，研究神经干细胞在不同细胞因子单独及联合作用下的分化情况是一个既复杂又重要的研究课题，而在体外探讨神经干细胞分化的相关实验中考虑血清的作用，筛选合适的体内外培养条件，将为神经干细胞移植及联合移植选择合适的培养和移植条件提供理论依据。
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发表于 2009-3-3 12:25
发表于 2015-5-26 19:54
