有人做过intracellular staining吗？

chumin

大家好，我想问一下有没有人做过intracellular staining，是针对非cell surface marker 的一种流式细胞仪的染色方式，进行intracellular staining之后可以进行与cell surface 相似的流式细胞仪分析或分选，但是我现在想回收一下分选细胞的total RNA ，不知可否，不知intracellular staining是不是会损坏细胞内的RNA ，毕竟RNA 易降解。; S7 L4 {2 Q8 w/ J# z7 F% L/ ]
谢谢　！

深海寂寞鱼

to chumin战友：" e' R4 b7 t( t4 A
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   标记细胞内抗原后进行细胞分选是绝对可以实现的，但是确实会对细胞内的RNA造成损失，比如说RNA的丢失，RNA的讲解。我尝试着查找文献，但是没有找到。1 w6 P, X5 J- u9 u+ \" n' t

* _8 {# i( i! Z& I5 B   这样做在理论上是可以实现的，如果你确实需要的话，完全可以自己尝试。
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   据我的经验有以下几点需要注意：
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   1.要做胞内蛋白染色，还是需要把细胞固定后再做染色。不然的在细胞穿孔过程中会有蛋白的丢失。你的抗体能进入细胞，细胞内的蛋白当然也能跑到细胞外。2 C4 s. U' z2 p
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   2.细胞穿孔时，尽量应用Saponin这样的可逆性穿孔试剂。$ T2 l' y: [# {+ z" B! U6 Y5 G
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   3.无论如何，只要你能把实验的过程完成，就一定能发现你分选出的细胞之间存在RNA表达谱的差异，但是应该会是高丰度RNA的基因，低丰度估计就要难一些。如果你是广泛的筛选实验的话，当然一定会有数据。但是如果你只想知道你感兴趣的基因是否有差异，那还需要一定的运气。
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: v/ M7 M0 `1 v# p4 |   4.为了防止RNA的降解，你所有的液体和试剂还是要尽量避免RNase的污染。比如，所有的水都使用milli Q纯水，最好是出水口带有Biopak处理器的那种。所有的枪头都用DEPC处理。# S% Q. f. R0 G" r
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   5.还可以考虑在你配置的液体里加入RNase抑制剂或者RNA保护剂。
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) N; \* C3 `' F: H2 ~    但是一切都需要你摸索。你也需要考虑成本效益原则。

chumin

真的太感谢了，讲的很明白，谢谢！