请教一个双酶切的问题

深海寂寞鱼

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  K: u5 V/ p7 Gto sidalin301：  x" X$ c- T; t. {
/ D+ g- }5 e  d& b9 M; ~. U
   你的问题描述的并不是太清楚。大致的意思是把目的基因从pUC57质粒上切下来，插入到pNL质粒中。但是因为没有pNL的质粒图谱，所以你担心可能会把序列反向插入，从而使目的基因不能表达。0 _; Y6 T" J: {% s

& l' J' r8 i! ~  e+ R  1. 解决这个问题的关键在于找到pNL质粒的图谱，如果没有图谱，一切都是在猜测之中。* p2 a& m  J7 F* y* k
   
0 ?0 K. m: D# f4 }2 }      我试着帮你找了找，在Addgene的网站一共找到了4个相关的质粒。（见下图）
( _- |9 J' z+ d; _& Q4 v      不知道你的质粒具体是其中哪一个？
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2010-10-19 13:11 上传

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  2. 我把这4个质粒的图谱都看了一下，其中并没有你说的同时存在BamH I和Nhe I的情况，倒是有同时存在BamH I 和 Nde I的情况。/ m7 _3 p+ Q$ X; W# O; i0 [
      希望你再核对一下你的质粒名称，以及酶切位点。- H& H! d3 G9 C

7 @7 E/ A/ O9 B# |  i  3. 如果你之前提供的信息是对的，那么当你插入你的目的基因后，它一定不会按照你想要的方式表达你的目的基因。目的基因的序列必须和启动子的方向一致，才能得以表达。
- T1 c. S( o9 @1 u5 Z. k: S9 }
" V( \* w0 k0 L) U6 _      如果是这样的话，我能想到的一个简单的解决方法，就是用一平一粘的方法把你的目的基因插入pNL质粒。# }/ a$ ]0 O  T1 C# V" {9 e. J4 W

4 E# b3 D, e2 M" N) J+ r      具体的步骤是：
- f. H- L- O5 h, X
* U$ A' z/ X. p. f4 B- ^' b! l4 A/ ~      a.用合适的酶把pUC57质粒和pNL质粒分别线性化； b.用klenow酶把切开的质粒进行平末端化；c. 用BamH I把平末端化好的质粒酶切，产生粘性末端；, d; l$ a8 V; N. K

" W" j6 F+ r3 y$ b# L8 M      d.然后分别回收你想要的片段进行连接。
1 K; k: W% [9 `. [) }6 C, v- W6 _- @; Y
     这样就可以把目的基因正向插入到pNL载体中了。# \2 `# p2 D5 h5 ?, ?

; N( p* f! T6 t3 m/ N% m* V    这只是我自己的一点想法，希望别的战友也能一起帮帮忙。

djj01

如果有起始密码，反向表达的多肽序列也是无意义的。。。

sidalin301

回复 11# 深海寂寞鱼 ! `8 U9 R$ L  l, T# c7 B8 G( A
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    太感谢你了！想不到你这么热情，我很感动！

sidalin301

回复 11# 深海寂寞鱼
; M2 I4 `: L" _; q+ O- G  Q6 p0 s; g3 G+ X0 X* D5 ~

2 h+ S$ A3 ^/ }4 \# d4 s: e    能把你的联系方式如QQ告诉我吗？我想以后请教就方便了！

sidalin301

反正就2种结果，方向相反和不相反，我先接上看会不会表达再说，如果不会就是反了，再从新接。- ^1 v! X: }1 b  j6 a, `! K
谢谢大家的热心帮助！

shiqingxi

选的酶不同应该是不会顺序相反的，质粒构建完成后，需要鉴定，测序什么的应该可以避免你这种问题的。