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作者：和梅1，郭元明作者单位：1．佳木斯大学附属第一医院神经内科，黑龙江 佳木斯 154003；PACAP MCAO 神经干细胞 分化 " D+ ~1 j; ]5 H' e7 D6 D/ s8 w
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【摘要】 目的：研究垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)对MCAO大鼠自体神经干细胞分化影响。方法：将大鼠随机分为不同浓度PACAP治疗组：P8组（1×10-8mol/L），P10组（1×10-10mol/L），P12组（1×10-12mol/L）；对照组。免疫荧光双标观察BrdU /NSE 及BrdU /GFAP 细胞的表达变化。结果：各组BrdU /NSE 及BrdU /GFAP 细胞7d时较少，14d显著增加，28d时最高，PACAP治疗组高于对照组（P
* E/ q; \) e8 X2 A. D" z" ] 【关键词】PACAP MCAO 神经干细胞 分化
1 g7 g- M4 O/ H Effects of Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide on the differentiation expression ofautoallergic neural stem cells in MCAO rat# d* x0 R I! Q* t, z
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HE Mei,GUO Yuanming) w" U" v, G* a5 n; _4 R9 ~
6 { f- s2 p. z) f2 z2 C1 i (1.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003，China;2.Postgraduate of Grade 2005,Jiamusi University,Jiamusi 154007，China). U5 G# {+ P" u7 K8 A) V
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Abstract:Objective:To investigate the effect of Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide(PACAP) on the differentiation expression of neural stem cells in MCAO rat.Methods:Rats were randomly divided into different concentrations of PACAP treatment groups: 8group (110-8mol/L), P10group (110-10mol/L),and P12 group (110-12mol/L) and control group.Imunofluorescence staining was applied to detection of the differential espression of Brdu /NSE and Brdu /GFAP positive cells.Results:At 7d,there were fewer BrdU /NSE and BrdU /GFAP positive cells in all groups,significantly increasing at 14d,and reaching the peak at 28d.The PACAP treatment groups were higher than the control group（P
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Key words：pituitaryadenylatecyclaseactivatingpo1ypeptide;middlecerebralarteryocclusion; neural stem cells;differentiation
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缺血性脑血管病是严重威胁人类健康的常见病和多发病，但有效的治疗手段仍然缺乏。脑缺血损伤后神经元的死亡不可避免，是治疗难以取得满意疗效的主要原因。目前，研究脑缺血损伤后自体神经干细胞的分化，弥补缺失的神经元，具有重要的临床意义。垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)对神经系统的作用多种多样，本实验旨在研究不同浓度PACAP对脑缺血大鼠自体神经干细胞分化的影响，为寻找新的诱导神经干细胞分化因子提供实验依据。/ o5 w- z3 h( z! g. _" S6 F7 R) A1 V
( v% C- S- J9 u: ~- A4 E/ A3 L 1材料与方法
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4 J8 H" p4 S, D2 H$ i. e F 1.1试剂与仪器
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垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)（北京博奥森生物技术有限公司）；BrdU试剂、小鼠抗大鼠BrdU一抗、兔抗大鼠 GFAP一抗、兔抗大鼠NSE 一抗（武汉博士德生物工程有限公司）等；FV500-OLYMPUS共聚焦荧光显微镜（上海精密科学仪器有限公司）等。) i# V. X) H. l* f/ K; s
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1.2动物及分组0 @/ w7 V& U4 E' F
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雄性Wistar大鼠72只（佳木斯大学实验动物中心提供），随机分为不同浓度PACAP治疗组(54只)：P8组（110-8mol/L，18只），P10组（110-10mol/L，18只），P12组（110-12mol/L，18只）；对照组（18只）。
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1.3模型制作及判定2 s. P& A# G8 `
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线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，于脑缺血2h再灌注后，参照Longa 5分制评分标准进行神经功能缺损评分。" ]: v# c& P! U0 C6 w( X. _' }
# S8 _8 e: n9 `$ x 1.4侧脑室注射药物$ Q* D8 V- b- b. x7 ~/ K& E
! h+ T4 K$ N5 x5 P) X0 K# _ 参照大鼠立体定位图谱，选择前囟后1.0mm, 中线旁开1.5mm，颅骨骨膜下5.6mm,PACAP经微量注射器注入侧脑室内，每次剂量为5μL，对照组给予剂量相同的生理盐水。
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* t& Q) w8 Q I. p6 ?4 }& j: s8 m' j 1.5组织固定及切片处理& E T/ ^8 E8 Y8 e: C
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各组大鼠分别于第7天、14天、28天断头取脑，4%多聚甲醛固定，梯度脱水，透明，石蜡包埋，切片，采用免疫荧光双标检测法，对梗死灶周边皮质BrdU /NSE ，BrdU /GFAP 细胞进行检测。% j( P8 k4 r+ p$ H3 \
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1.6数据处理# ?9 w8 q e5 L5 ~
8 J4 y2 B5 ]$ |; \1 f# k# f, b0 L
. y x2 X s% N) b8 c. W: Y
* [/ r8 f" V% L% \: D( K4 l" J 各组数据用x±s表示，应用SPSS13.0软件处理，多个样本均数间比较用方差分析，组间比较用q检验。
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) Q8 f$ ^& o+ E+ }/ k6 r4 x0 _$ a 2结果 L0 S' r+ v, s
) ~1 S7 k/ ]7 M9 @$ M6 H; y
各组BrdU /NSE 及BrdU /GFAP 细胞变化情况：各组BrdU /NSE 细胞在7d时较少，14d显著增加，28d时最高；相同时间点，PACAP治疗组高于对照组（P
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: X" O; d$ G0 Q7 L 3讨论
) G: {" L+ P5 V0 Z( {1 w# }% Y. [9 ~& u
Wess S等［1］研究表明PACAP对体内外的神经干细胞均具有显著的激活和促进增殖的作用；本实验利用免疫荧光双标技术，动态观察各组实验动物梗死灶周边皮质BrdU /NSE 、BrdU /GFAP 细胞的表达变化，结果表明PACAP具有诱导神经干细胞分化的作用，可能与以下机制有关：①PACAP通过结合受体PAC1-R激活腺苷酸环化酶，催化ATP转化为cAMP，后者随之激活cAMP依赖性蛋白激酶 A(PKA)，PKA又可使胞内多种蛋白质磷酸化，产生生理作用［2］。②PACAP与受体结合后首先与G-蛋白偶联使之激活，在磷脂酶C的作用下，磷酯酰肌醇二磷酸水解为肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG).IP3可增加胞内钙离子的释放，DAG则激活蛋白激酶C(PKC)。PKC和钙离子-钙调蛋白依赖性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶以及酪氨酸激酶的激活，使胞内相应的蛋白质磷酸化，诱导神经干细胞分化［3］。本实验选择了三个浓度PACAP，分别为110-8mol/L，110-10mol/L，110-12mol/L，结果表明，同一时间点BrdU /NSE 及BrdU /GFAP 细胞数，P8组高于P10组，P12组(P＜0.05)，表明PACAP在诱导神经干细胞分化时具有一定的浓度依赖性，其机制可能是高浓度的PACAP结合更多的受体，进而发挥更强的作用［4］。
( }. ]& g9 {3 C' E5 A: r 【参考文献】6 i) x' D0 I- o+ Q1 X" N: {
［1］Weiss S,Ohta S,Gregg,et al.Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide regulates forebrain neural stem cells and neurogenesis in vitro and in vivo［J］.Neurosci Res，2006,84(6):117711867 E- q0 k- x3 ~6 U6 H
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; H& A# Q2 _6 O) }, p) S8 P ［2］See V,Kech B,Loeffler JP.C2-ceramide and reactive oxygen species inhibit pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP)-induced cycli-AMP–dependent signalling pathway［J］.Neurochem，2001,76(3):778788+ P3 U& n& I7 o0 l5 w3 m
1 E e; i5 Y" {. z+ q* a# h6 n5 N5 O$ E4 b% u
1 ?) j* t$ j$ A5 [; U$ i
［3］MacKenzie CJ,Lutz EM,Johnson MS,et al.Mechanisms of phospholipase C activation by the vasoactive intestinal polypeptide/pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type 2 receptor［J］.Endocrinology，2001,142(3):12091217$ l ?$ r o/ Q8 e
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［4］Vaudry D,Gonzatez BJ,Basille M,et al.Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide stimulates both c-fos gene expression and cell survival in rat cerebellar granule neurons through activation of the protein kinase A pathway［J］. Neuroscience，1998,84(3):801812 |
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发表于 2009-3-3 12:27
发表于 2015-5-27 20:12
