端粒酶活性在骨髓间充质干细胞中的表达



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发表于 2009-3-3 12:28 |显示全部帖子

作者：王海莲作者单位：山东大学齐鲁医院
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      【摘要】  目的  探讨骨髓间充质干细胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells MSCs)端粒酶活性的表达并检测其部分生物学特性。方法  取正常成人骨髓用含10%新生牛血清的LGDMEM培养液培养、扩增。流式细胞仪行细胞表面抗原检测，细胞化学染色鉴定其生物学特性，观察其在地塞米松、β甘油磷酸钠、维生素C特定培养条件下向成骨细胞分化的能力，采用TRAP（Telomerase repeat amplification protoco1 assay)银染法测定其端粒酶的活性。结果  分离培养获得的贴壁细胞，碱性磷酸酶染色阳性。流式细胞仪检测CD34、CD45呈阴性表达，CD29、CD44呈阳性表达。经向成骨细胞诱导3周后，可得到成骨细胞，经茜素红染色得到证实。TRAP银染法证实MSCs表达一定的端粒酶活性。结论  体外分离培养的MSCs可以向成骨分化，表达一定的端粒酶活性，具有干细胞的特性。
      【关键词】骨髓干细胞诱导分化端粒酶活性
   Abstract: ObjectiveTo explore the telomerase activation of bone marrowderived mesenchymal stem cells(MSCs) and its biological characteristics. MethodsBonederived MSCs were cultured in Dulbecco′s modified eagle′s medium(DMEM) with low glucose containing 10 % new bovine serum. A flow cytometer(FCM) was used to determine the expression of cell surface molecules, and cytochemical staining was used to identify their biological characteristics.Osteogenic differentiation was assessed in low glucose DMEM containing dexamethasone, βsodium glycerophosphate and vitamin C. Telomerase repeat amplification protocol assay（TRAP）argentation method was used to determine the telomerase activation. ResultsMSCs could be isolated and cultured from bone marrow and they were negative for CD34 and CD45 but positive for CD29 and CD44. Three weeks after inducement by osteoblasts, they were positive for alizarin red staining and expressed telomerase activation. ConclusionMSCs isolated and cultured from adult human bone marrow can be induced into osteoblasts, and express telomerase activation and have stem cell biological characteristics.* O, J5 e/ q' q4 G/ I$ @/ `4 }3 P

Key words: Bone marrow; Stem cells; Induction differentiation; Telomerase activation近年来大量研究表明，端粒酶是一种自身携带RNA模板的逆转录酶，具有催化端粒DNA合成、延长端粒寡核苷酸片段、维持端粒长度的功能，从而调节体细胞的增殖并保持细胞有限增殖力。骨髓干细胞包含造血干细胞和基质细胞两大类，基质细胞中有一类间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs)，它具有多向分化能力，可以分化为心血管细胞、中枢神经细胞、肺细胞、肾脏和皮肤细胞等［15］。但其在骨髓中的含量极少，因此我们建立了一种简单、有效、可行的分离方法，对其端粒酶的活性做了检测，进一步证实了其具有干细胞的生物学特性，为将来向的诱导分化和临床应用奠定基础。1 ~$ Q' _: {7 t& s7 [
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1材料与方法
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1.1标本与试剂骨髓标本来自本院成人骨髓检查结果正常者。LDMEM、新生牛血清购自Gibco公司。荧光标记小鼠抗人单抗CD45PE、CD34FITC、CD44FITC、CD29PE和小鼠同型阴性对照IgG1FITC,IgG2PE 购自晶美公司。吲哚美辛、胰岛素、地塞米松、油红O、茜素红染料、碱性磷酸酶染色试剂盒购自Sigma 公司。TRAP银染法端粒酶活性检测试剂盒购于KeyGEN公司。$ l1 e7 L6 s# x) ?) ^8 e/ a
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1.2骨髓MSCs的分离培养无菌条件下取骨髓2 5?mL，肝素（50?u/mL）防凝。1∶2体积稀释后，利用percol密度梯度离心法获取单个核细胞，以1106/cm2细胞数的密度接种于培养瓶中,加入LDMEM培养液(含10%新生牛血清),置37?℃, 5%CO2的饱和湿度的细胞培养箱中, 48 72?h初次换液, 以后每3 4?d换液。待贴壁细胞达到80% 90% 融合后, 用含0.25%胰蛋白酶37?℃消化, 以1∶3的比例传代。& F: I# u+ g& c1 G0 z* q- C" b

1.3细胞化学染色取3 6代以后MSCs，用0.25%胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬液，按1105/mL?细胞数种植在铺有载玻片的六孔板中，制备细胞爬片，进行碱性磷酸酶（ALP）染色，操作按试剂盒说明进行。3 S/ @8 n% D+ E, I2 |$ S

1.4免疫表型的检测取第36代后的贴壁细胞达到80% 90%融合后,用0.25%胰蛋白酶消化, 制成1106/mL的细胞悬液。分别加入荧光标记小鼠抗人单抗CD45PE、CD34FITC、CD44FITC、CD29PE, 和同型阴性对照小鼠抗小鼠IgG1FITC, IgG2PE各10?μL,每管加入细胞悬液100?μL,室温下反应30?min,每管加1.5?mL PBS,1?200?r/min离心5?min, 弃上清, 每管加入100?μL PBS, 流式细胞仪检测。

1.5向成骨细胞的诱导分化取第3 6代后培养细胞，以1106接种于放有盖玻片的6孔培养板，3个孔作为对照一直加普通培养液培养，另外3个孔用于诱导分化培养。当培养细胞达50％ 60％融合时，换成成骨细胞诱导分化培养液（DMEM含0.1?μmol／L地塞米松、l0?mmol／L β甘油磷酸钠、50?μmol／L维生素C）每3 4?d换液一次。21?d后进行细胞化学染色：弃掉培养液PBS洗两遍，4%多聚甲醛固定，PBS洗两遍，做细胞化学染色。用1%茜素红染色30?min，三蒸水冲洗。

1.6的端粒酶活性的检测操作按照试剂盒说明进行。① 细胞端粒酶的提取取第3 6代后的贴壁细胞, 阳性对照细胞取自人卵巢癌细胞。用0.25%胰蛋白酶消化, 制成1106/mL的细胞悬液。按试剂盒的说明加入裂解液，把离心上清转移至新的管中，放置冰上并测定其蛋白浓度。获取其端粒酶提取物；② PCR扩增将2?μL的提取物加入PCR反应液中，进行PCR反应。设定程序： 94?℃ 30?sec； 50?℃ 30?sec，72?℃ 90?sec循环27次；最后72?℃延伸5?min；③ 聚丙烯酰胺凝胶电泳制备12%非变性聚丙烯酰胺凝胶。取9?μL PCR产物加上1?μL 10上样缓冲液，在电压180?V，12%非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳1?h; ④ 银染将凝胶置10%乙酸固定30?min，然后蒸馏水漂洗；0.2?g/L硫代硫酸钠浸泡1?min，蒸馏水漂洗3遍；硝酸银染液浸泡30?min，蒸馏水漂洗15?s；显色10?min左右直到全部条带显色为止；最后置于10%乙酸终止反应。拍照。

2结果1 p( r+ a8 {* J1 _
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2.1骨髓MSCs的生长特性骨髓MSCs种植48 72?h开始有少量细胞贴壁，梭形，散在分布，以后贴壁细胞逐渐增多。3 4?d换液一次，1周左右见大部贴壁细胞呈纤维束状排列，胞浆饱满，细胞生长迅速。也有少量圆形细胞散在。约2周时细胞达70% 80%融合，呈放射状，漩涡状走行，首次传代。第3代后，镜下观察为梭形的成纤维状细胞（图1）。# [3 O' w$ b5 N: }
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2.2细胞化学特性细胞化学染色显示MSCs的ALP表达阳性，以细胞核为中心，散在棕黑色的颗粒（图2）。
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2.3免疫表型流式细胞仪检测显示MSCs表达CD44、CD29、CD34、CD45阳性率分别为97.8%、94.8%、0.2%、0.2%（图3，4）。
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2.4向成骨细胞的诱导分化向成骨细胞诱导时，细胞在无血清培养液中,镜下观察骨髓MSCs随时间推移变宽、扁，3周后，茜素红染色显示深红色沉积物，证实细胞内钙的形成（图5，6）。
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2.5端粒酶活性阳性对照人卵巢癌细胞在凝胶电泳上显示6?bp的梯形条带，颜色较深。人骨髓MSCs显示梯形条带，但颜色较浅（图7）。图5成骨细胞诱导3周后，茜素红染色阳性(100)

3讨论- [; O1 }) g5 z

骨髓中除造血干细胞外还存在一类间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs），基因和超微结构表明MSCs具有强大的可逆性［6］。MSCs在骨髓中的含量很低，需要在体外分离纯化和大量扩增。有研究表明扩增一代到两代后，MSCs的纯度分别达到95%和98%［7］。本实验联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法，使获得的MSCs尽可能为同源细胞，从而提高其纯度。同时我们对所培养的MSCs进行了ALP染色，结果呈阳性反应。这说明骨髓的MSCs也具有骨细胞的特性。" V! p& ]  [. `+ s8 w

MSC的表面标志具有非单一性的特性，目前一般认为CD29、CD44、CDl05、CDl66及SH2、SH3是MSC的重要标志物。MSC表面不表达造血细胞表面抗原，如造血前体细胞表面抗原CD34、白细胞表面抗原CD45等，证明MSC为一群非造血类细胞。本实验通过流式细胞术检测并鉴定了由克隆扩增出的MSCs具有高度的同源性，可通过其表面抗原结合细胞外基质，参与细胞——细胞之间或细胞——基质之间的相互作用，具有产生细胞外基质蛋白和细胞因子的功能［8］。骨组织基质包括有机质和无机质两种成分，无机质是骨盐(主要成分为羟基磷灰石结晶)，有机质包括骨胶原纤维和无定型的有机质，骨胶原纤维蛋白主要是Ⅰ型胶原，是钙盐沉着和细胞附着的支架。参照国外有关文献［7］，本实验配制简单的成骨诱导液，经过茜素红染色染色发现MSCs先后出现特征性的骨细胞标志，与国内外相关研究类似。/ O6 \9 ^) p1 `. G, S. ]" }
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端粒是真核细胞染色体末端的结构，细胞每分裂一次，其端粒DNA序列就会丢失若干长度。当端粒DNA序列缩短一定长度时细胞就会停止增殖，并逐渐衰老、死亡。端粒酶能特异性地识别端粒引物位点，并复制端粒添加到染色体末端，以补充由于细胞分裂时端粒DNA的丢失，从而维持端粒长度。因此，端粒酶活性间接反应了细胞增殖能力的强弱。大多数正常体细胞通常无端粒酶的表达，而生殖细胞，造血细胞和肿瘤细胞有较高的端粒酶活性。干细胞的端粒酶活性与其所处的细胞周期密切相关。处于静止期的细胞端粒酶活性低水平表达。在本实验中，人骨髓MSCs的端粒酶活性呈阳性反应，但其反应强度明显弱于作为对照的卵巢癌细胞的端粒酶活性，这说明该细胞较幼稚，生命周期较长，不具有恶性肿瘤的无限增殖能力。有报道骨髓MSCs在l2代以内核型正常，且保持端粒酶活性［7］，与本实验结果相吻合。
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本研究结果显示，人MSCs可通过抽取骨髓分离获得，易培养扩增；经体外的诱导后具有明确的多向分化的干细胞潜能。因此，人MSCs是目前较为理想的组织工程种子细胞来源，具有良好的临床应用前景。
      【参考文献】
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