关于慢病毒转染成功与否的一些疑问

leedh1223

现在我用的是只带有GFP基因的慢病毒转染神经干细胞球，在转染96小时后进行观察，在显微镜视野下观察不到有绿色荧光，于是在电脑上拍照工具里将曝光度调到1.7秒后看到了有荧光，当曝光度再增加的时候，荧光强度就更亮了。
$ `+ G+ k& \9 R8 ?" K5 A: o' d我想问的是慢病毒整合以后表达GFP蛋白的程度与荧光的强弱有直接关系吗？一般情况下，大家的慢病毒转染后检测到有荧光，曝光度是多少呢？

leedh1223

补充一下，对照组也有很少量的荧光，但是没有听说过神经干细胞也有自发荧光的呀

quit6927

曝光时间增长的话，背景也会出现信号的，而且三维的更容易出现背景。曝光时间没有一个固定值，不同培养皿，培养皿不同部位都有影响。个人觉得，曝光时间的确定最好拿没有转染的对照组，同样培养皿，差不多的位置，来确定。我们以前GFP，1s以下。

leedh1223

也是慢病毒转的GFP吗？我用的是96孔培养板

daviddow

一般我都是在转染48小时，观察荧光的。你可以让他自动一下就可以。我的40倍的400，100倍的200,200倍的100毫秒就可以。

quit6927

回复 4# leedh1223
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3 v! R  C; E+ r) _我以前用的就是lentivirus，关键还是要和阴性对照比，不同显微镜，不同载体，GFP或者EGFP。再说显微镜只是个定性，它也定不了量。对于我以前用的Zeiss的显微镜，1.7s的爆光时间肯定是太长了。

ayeqiu

我拍照时用的都是自动调节，慢病毒转染后24小时就拿去拍照，能看到少量荧光，并且也很亮。

leedh1223

恩，谢谢各位高手指教

王乾

荧光的强弱肯定是和GFP蛋白在细胞中的丰度直接相关的，但荧光有多亮根本上还是取决于gfp前面的promoter在你感染的细胞中有多强，另外感染进去了多少个拷贝。前者举个例子，我用CMV-GFP和EF1a-GFP的病毒去感染mES，感染的情况是前者ES没后者ES亮，后者MEF没前者MEF亮，这就说明CMV在MEF细胞里比在ES细胞里强，而EF1a-GFP在ES里很强。
) d; P) D0 D$ H, g% f" R7 V关于拷贝数就更简单了，越多越亮，我是想说的拷贝数主要和被感染细胞的种类、细胞的状态和病毒的滴度、MOI直接相关，所以病毒感染时尽量在细胞生长良好时，滴度主要是转染效率要高，收病毒的时间要控制好，真不行就浓缩，慢慢的总结一些经验，总会感染好的。

FYH

1 ^: ]: k2 s' b( h- Y

% S7 E8 W' F" w9 c1 \先在自动曝光的条件下观察　若是感染上　会有些荧光　谈的话再人工调整曝光时间　　最好在１秒以下,不然没科学性.培养基的杂质有时也会发光,这种光质地不均匀,对于ＧＦＰ或EGFP而言,若是杂质发光　,光往往带有一定的黄色.