关于病毒滴度的测量的问题？

cc1986

最近在用 稀释计数法 测量慢病毒上清的滴度) }9 {$ y" i! g- D4 L; H. R$ |
操作如下（众多操作手册里推荐的步骤）：感染前一天1*10 5次方 3T3细胞接种于六孔板 —— 加聚凝胺终浓度8微克每毫升，和病毒上清（梯度稀释到10的负6次方）感染24小时——后加选择培养基G418 （500微克每毫升），开始筛选1周，最后数最低稀释倍数下的细胞克隆数，计算滴度值
- G* A+ w# R, T9 k, T我遇到的问题是：筛选刚刚开始细胞长满了，这时候是不是应该传代？
* [4 ~, y5 v& {6 e; b' C   理论上我认为不应该传代，因为此方法基于的原理就是已转导成功的细胞克隆数来评估病毒滴度，转导成功获得稳定表达的细胞肯定是要分裂的。这时候如果我消化传代，同一细胞克隆的后代肯定会分开各自形成新的克隆，这样最后的克隆总数肯定是要高的多，计算的滴度值就比实际的大了吧。 . ^' J! M) q) x6 q! e4 ~  t& m! P
   但是不传代，细胞又长得太满了，对细胞也是一种损害吧？ 是不是我的筛选浓度或者接种密度偏大？$ }* g8 M& U* y9 n
   希望做过的人给指点迷津,谢谢~~

quit6927

不传代，通常感染的时候，细胞长到70%左右。如果筛选浓度对的话，没转染上的就应该死翘翘了。关于筛选浓度的选择和如何滴定，我手头的PLKO lentivirus（addgene）的手册，你可以参考看看。

cc1986

回复 2# quit6927
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非常感谢~~我看还是以前筛选浓度有问题，需要重新确定一下最佳浓度~

wangming

调整好感染细胞的密度，一般是转染细胞生长到60～80%的汇合度时进行。

王乾

可以传代。因为被感染的细胞理论上的分裂速度和没被感染上的一样啊，比如100个细胞感染上10%，即10个细胞，分裂一带后，200个细胞应该还是10%，20个，所以你怎么传代理论上比例都不会变的，当然你要是挑稳转克隆就不能这么干了。) f0 `) k. p  r  s' W7 v* K
还有，我决的你在加药杀的时候要是老是长满，我决的肯定是要么细胞接的太密，要么药加的浓度太低（不同细胞和不同抗生素浓度是不一样的），或者病毒加的太多以至于被感染上的细胞比例太大，所以你可以在这上面先找一下原因。* N% `6 K* A  [% [
祝君成功！

cc1986

回复 5# 王乾
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    非常感谢，说的很好~~