人骨髓间充质干细胞的分离、培养和体外定向诱导成类软骨细胞的实验研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:29 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：李林  金连弘  李冬梅  李秋明  于宏伟作者单位：哈尔滨医科大学组胚教研室硕士研究生，现在齐齐哈尔医学院组胚教研室（李林）哈尔滨医科大学组胚教研室（李冬梅、李秋明、于宏伟）

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      【摘要】  目的  建立一种体外分离培养、纯化扩增人骨髓间充质干细胞（MSCs）的方法，一定条件下诱导人MSCs定向分化成软骨细胞，为组织工程提供软骨种子细胞。方法  用单纯的贴壁培养法与密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化成年人MSCs；体外加自行配制软骨诱导剂，诱导2、4、6代MSCs细胞14d做免疫细胞化学比较；取2代MSCs不同浓度TGF-β1（5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml），诱导14d做免疫细胞化学比较。结果  软骨诱导后2、4、6代MSCs均表达Ⅱ型胶原，无显著性差异；不同浓度TGF-β1诱导2代MSCs，均表达Ⅱ型胶原，其中10ng/ml组和20ng/ml组Ⅱ型胶原呈强阳性。结论  不同代的MSCs诱导率无明显差异；TGF-β1浓度为5ng/ml组Ⅱ型胶原弱阳性，不适合作为组织工程种子细胞；诱导软骨TGF-β1最适浓度为10ng/ml、20ng/ml。
      【关键词】人  骨髓间充质干细胞  生物学特性  分化  软骨  TGF-β1
   　　间充质干细胞(mesenchymal stem ce11s MSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞。在适当的诱导条件下，MSCs 可以分化为中胚层细胞，包括成骨细胞、软骨细胞等［1-2］与Escs相比，Mscs易分离，体外可大量扩增，异体移植小不引起免疫排斥反应。便于自体移植。故被认为是软骨组织工程最有希望的种子细胞来源之一。本实验旨在建立一种体外分离培养、纯化扩增人骨髓间充质干细胞（MSCs）的方法，在一定条件下诱导人MSCs定向分化成软骨细胞，为组织工程提供软骨种子细胞。

　　1材料与方法+ U& j& }5 w& w$ V8 K. p9 }
. g9 c7 u4 k( P- P4 _- M
　　1.1材料+ J2 b7 q( I( R/ [

　　1.1.1主要试剂LG-DMEM培养液、优质胎牛血清、地塞米松干粉、维生素C干粉、胰岛素、淋巴细胞分离液、Rabbit Anti-Collagen TypeⅡ、羊抗兔IgG、SDAB试剂盒/ @3 X8 a" a& X6 X6 {: M' d9 z
: Z" B# Q" q3 ~
　　1.1.2骨髓来源成年健康志愿者3人，年龄20~50岁。+ e; e! \! ?# m$ U/ z, ^
' ?1 [6 x$ [+ P7 `- Y
　　1.2方法用单纯的贴壁培养法与密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化成年人MSCs；体外加自行配制软骨诱导剂，诱导2、4、6代MSCs细胞14d做免疫细胞化学比较；取2代MSCs不同浓度TGF-β1（5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml），诱导14d做免疫细胞化学比较。8 p4 ^* f) u3 P. J

　　1.3统计学分析实验组与对照组的阳性率比较用χ2检验。

　　2结果
/ ~. U) T) u1 x$ u
　　2.1倒置相差显微镜观察
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　　2.1.1原代培养：骨髓单个核细胞刚接种时，细胞分散，MSCs与周围的血细胞相混杂，不易区分。骨髓单个核细胞接种3d，，贴壁MSCs的形态逐渐延伸成梭形，即成纤维样细胞。8d后，MSCs进一步伸展、增殖，可见MSCs形成集落，随着集落不断扩大，细胞呈放射状向周围扩展，逐渐与邻近集落相汇合。

　　2.1.2传代培养：刚传代的细胞呈圆形，很快贴壁逐渐变成长梭形，贴壁细胞均匀分布，形态趋于同一，3~5天增殖速度明显增快，约6~7天长满培养瓶底，可见MSCs呈成纤维样紧密排列，漩涡样生长（图1）。7 d0 j5 o) Q% D$ R% D2 d
4 s7 q4 N. Z/ R# _% u
　　2.1.3诱导培养
3 e8 l/ c) f0 s( g# z& n
　　2.1.3.1不同代的诱导培养（20ng/ml TGF-β1、6.25μg/ml胰岛素、50μmol/L维生素C、6.25μg/ml转铁蛋白、青霉素100μ/ml、链霉素 100μ/ml）诱导第二代、第四代、第六代MSCs，在倒置显微镜下观察均比较相似，诱导14d，MSCs变成圆形或多边形，核清晰，核周可见密集的黑色颗粒。对照组MSCs无明显改变。4 k( v% ^+ k/ h; P* N- T

　　2.1.3.2不同TGF-β1浓度的诱导取第二代MSCs TGF-β1浓度分别为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml，除TGF-β1浓度为5ng/ml组的诱导率略低，其他形态变化上比较相似，诱导14d，MSCs变成圆形或多边形，核清晰，核周可见密集的黑色颗粒（图2）。对照组MSCs无明显改变。& w% Q3 Q$ j. d" F/ W

　　2.2人骨髓MSCs的生长曲线1~3天细胞生长缓慢，约4天进入对数生长期，6~7天传代培养的细胞达到90%的融合，进入生长平台期。) J3 u# m) \1 l' l
  n- ]- D8 @& I0 C0 F+ D
　　2.3流式细胞仪分析CD45 99.66％的细胞为阴性;CD14 99.59％的细胞为阴性;CD34 99.71％的细胞为阴性，可排除为造血谱系细胞。可证明该细胞非造血干细胞而是骨髓间充质干细胞。

　　2.4Ⅱ型胶原免疫组化染色
1 W/ u' y' ]  u8 {( G) U
　　2.4.1TGF-β1浓度为20ng/ml诱导P2、P4、P6MSCs 14d时，镜下观察相似，大量MSCs变成圆形或多边形，胞核清晰蓝染，胞浆可见清晰的密集棕褐色颗粒。; p0 p" c7 n- X% a
. D) D" R) x" k2 V1 C; [( b
　　2.4.2TGF-β1浓度为5ng/ml诱导第二代MSCs 14d，少量MSCs变成多角形或多边形，胞浆可见着色较浅的棕褐色颗粒。TGF-β1浓度为10ng/ml、20ng/ml诱导第二代MSCs 14d，大量MSCs变成圆形或多边形，胞浆可见清晰的密集棕褐色颗粒（图3）。对照组MSCs 呈长梭形，胞浆未见棕褐色颗粒。
: x! e% T' T+ Z% C9 k9 M
　　图1－　图3略+ G9 G/ N; M; k
2 k! {+ x' B- s8 ?  z: m
　　2.5统计学分析
/ J* k7 c: Q! w0 n- u+ }6 h4 J9 l
　　2.5.1见表1。

　　表1不同浓度TGF-β1诱导Ⅱ型胶原免疫组化阳性率的比较（略）) s( M9 z( Y( p0 c$ ?
' H7 p0 e4 C) n( D
　　8 x) k. c& M; F/ `

　　实验组阳性细胞均值与对照组阳性细胞均值比较采用t检验，P均0.05，说明各个浓度阳性率没有显著性差异。但5ng/mlTGF-β1诱导MSCs时，MSCs表达Ⅱ型胶原较少，只呈弱阳性，没有形成典型的类软骨细胞。6 c% ]0 z. V, K$ _" m& N4 ?* T
$ b% w; r% ~. w
　　2.5.2见表2。; j" F& _  N; x# i3 P
8 a* R8 R1 {$ o
　　表2不同代MSCs诱导后Ⅱ型胶原免疫组化阳性率的比较（略）
1 L0 n/ x9 B) K: p! y
　　3讨论

　　自发现骨髓间充质干细胞的存在并建立骨髓间充质干细胞分离培养的方法以来，有关MSCs的研究正逐渐深入。MSCs能在特定条件下可诱导分化为成骨细胞，还具有体外易纯化、培养、操作等特点，MSCs是理想的组织工程启动细胞，为软骨损伤的修复开辟了一条新的途径。分离培养MSCs是本实验的关键。本实验采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法和反复贴壁筛选法相结合，所获的细胞形态均一，增殖速度快，生长性状稳定，在连续传6 代后未出现退化现象,具有MSCs 一般的特性［3］；且操作简便，成本低。本实验选用CD14、CD34、CD45排除法作为鉴定MSCs的指标。本实验中所分离培养的第二代MSCs的表面抗原流式细胞法检测，不表达造血细胞谱系的CD14、CD34、CD45；可见所分离的细胞，不属于造血系细胞，属于骨髓间充质干细胞。MSCs向软骨细胞的定向诱导是本试验的重点，Ⅱ型胶原主要存在于软骨中，因此被作为MSCs分化为软骨的主要特异性蛋白。目前发现的具有体外促进软骨分化的细胞因子和激素常见有效的为转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)能显著刺激软骨细胞的增生、分裂和分化［4］。本实验探讨诱导成软骨细胞的单层培养体系。在本实验体外诱导中，用20ng/mlTGF-β1诱导人MSCs14d，可见大部分MSCs由长梭形向软骨细胞的圆形或多边形转变，同时细胞开始分泌软骨特有的Ⅱ型胶原蛋白。TGF-β1为MSCs进入软骨表型分化提供了一个适宜的外部信号［5］，在诱导中是必要的。TGF-β1可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞，但和浓度有关，本实验设定三个TGF-β1浓度不同的诱导组。浓度为TGF-β1浓度为5ng/ml时Ⅱ型胶原弱阳性。而10ng/ml、20ng/ml的浓度可有效的诱导人MSCs分化为软骨细胞，合成特异性Ⅱ型胶原和蛋白多糖，在而且TGF-β1浓度为20ng/ml时转化率最高，其促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质的合成的能力最强。5ng/mlTGF-β1诱导MSCs时，MSCs表达Ⅱ型胶原较少，只呈弱阳性，没有形成典型的类软骨细胞，杂细胞多不适合临床应用。经形态学、免疫组织化学分析证实，TGF-β1为10、20ng/ml能有效诱导后细胞分泌Ⅱ型胶原，呈现出典型的软骨细胞表型。在实验中，我们发现分别取不同传代次数的细胞体外诱导，细胞的诱导率没有差异性。用此诱导培养体系，诱导的骨髓MSCs阳性率高，杂细胞少，能满足治疗和移植的需要，有一定的现实意义，为软骨组织工程的发展提供了实验基础。
      【参考文献】
　　［1］  Pereira R F,Halford K W,O’Hara  M D,Leeper DB,Sokolov BP,Pollard MD,Bagasra O,Prockop DJ.Cultured adherent cells from  marrow can serve as  long-lasting precursor cells forbone,cartilage,and lung in irradiated mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:4857-48610 g) o9 p! K. G. O

" w4 z, k8 W& \, S4 I& q( G  i: F

　　［2］  Kadiyala S,Young R G,Thiede M A,Bruder SP.Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro［J］.Cell Transplant  1997,6：125-134
) e& ~8 f! H5 [% a8 C5 Y2 @
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　　［3］  Bianco P,Riminucci M,Gronthos S,et al.Bone marrow stromal stem cells:nature,biology,and potential applicatons［J ］.Stem Cells,2001,19(3):180-192' f% r* k1 {. {

. K* A: g- R3 X  d

　　［4］  Roelen BA,Dijke P.Controlling mesenchymal stem cell differentiation by TGF-Beta family members［J］.J Orthop Sci,2003,8(5):740-748
; o* q0 i1 R# R$ E' f% h# ?

　　［5］  Yoo JU,Barthel TS,Nishimura K.The chondrogenic potential of human  bone-marrow derived mesenchymal progenitor cells［J］.J Bone Joint Surg Am,1998,80(12):1745-1757

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