粒细胞集落刺激因子动员大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的实验研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:29 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：史力生  齐晓勇  李树人  彭应心  孟存良  刘惠良作者单位：河北省人民医院心脏中心，河北  石家庄  050051 ( C  s, V) o, `$ G

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      【摘要】  目的  运用粒细胞集落刺激因子诱导骨髓间充质干细胞(MSC)移植归巢到急性心梗区域，研究不同环境下MSC在心肌内的分化状态及程度。方法  选用SD雄性大鼠，体重200～250 g，随机分为4组:急性心肌梗死(AMI)干细胞移植粒细胞集落刺激因子(GCSF)动员组(20只)、AMI干细胞移植组(20只)以及单纯GCSF组(20只)以及单纯对照组(10只)。于治疗4 w后取材，检测心肌梗死区及其周围的血管密度值。免疫组化染色检测抗体增殖细胞核抗原(PCNA)、肌浆蛋白(myogenin)、肌球蛋白(myosin)、缝管连接蛋白43(Cx43)及结蛋白(desinmim)在移植骨髓间充质干细胞中的表达。并用共聚焦免疫荧光双标染色方法标测PCNA、myogenin。结果  胶体金标记的MSC经GCSF诱导移植到心脏内在梗死部位与心肌生长为一体，颜色为黑色，在HE切片中移植细胞的胞浆呈现紫红色，极易识别。血管密度检测结果显示GCSF MSC移植组心肌梗死区血管密度明显高于其他各组。免疫组化染色检测抗体PCNA、myogenin、myosin、Cx43及desinmim在GCSF MSC移植组心肌梗死区中的表达明显。其他各组未见明显表达。结论 GCSF能够明显动员MSC归巢,促进梗死区血管新生，在梗死区分化成新的心肌。 7 t0 R; {) p. [& X( ?
      【关键词】干细胞移植；粒细胞集落刺激因子；心肌梗死0 l& i6 r7 p  n* H* [& ~$ S: \
   　　骨髓细胞移植在治疗急性心肌梗死(AMI)方面已表现出传统治疗方法无可比拟的优越性，干细胞的多分化潜能及可塑性已经得到公认〔1〕。但是干细胞移植到体内后的存活、驻留、分化及移植细胞的示踪标记仍是制约干细胞发展的关键问题〔1，2〕。本研究通过建立冠状动脉梗死模型，即刻用胶体金标记的骨髓间充质干细胞(MSC)后移植到急性心梗区，并运用粒细胞集落刺激因子(GCSF)进行诱导归巢,研究不同环境下MSC在心肌内的分化状态及程度。, ]: f% x6 F' ]' s4 e# X
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　　1材料与方法

　　11动物选用4月龄SD雄性大鼠70只，体重200～250 g，购于河北医科大学动物实验中心。随机分为4组:急性心肌梗死(AMI)干细胞移植粒细胞集落刺激因子(GCSF)动员组(20只)、AMI干细胞移植(MSC)组(20只)、单纯GCSF组(20只)以及单纯对照组(10只)。分别于治疗4 w后取材。7 Z/ _9 z5 e, f5 H/ P
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　　12方法

　　121试剂与仪器DMIMF12培养基(美国GIBCO公司),胎牛血清(FCS,美国Hyclone公司),Percoll分离液(美国Sigma公司)，01%胶体金溶液(美国Sigma公司)，羊多克隆抗体肌钙蛋白Ｉ(troponinＩ)、羊多抗连接蛋白43(connexin43)，肌浆蛋白(myogenin,鼠抗人单克隆抗体，北京中山生物公司)、肌球蛋白(myosin,鼠抗大鼠单克隆抗体，博士德生物公司)、细胞核增殖抗原PCNA(鼠抗大鼠单克隆抗体，博士德生物公司)、结蛋白(desmin，鼠抗大鼠单克隆抗体，博士德生物公司)、缝管连接蛋白Connexin43(Cx43,兔抗人多克隆抗体,博士德生物公司)免疫组化染色，鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体(北京迈新生物技术开发公司)。$ L5 }' z- O5 \1 T: S8 P% s) g

　　122ＭＳＣ的分离、纯化、扩增培养及标记取200～250 ｇ Wistar大鼠,无菌条件下采集双侧股骨、胫骨,用适量DMIMF12培养液冲出骨髓,200目筛网过滤,离心去脂肪层,加DMIMF12培养液制成细胞悬液,用比重1073的Percoll分离液分离(2000ｒ/min,20 min),取界面层,用PBS离心洗涤(200 g,5 min),以2 0105/cm2的密度接种于完全培养液(DMIMF12 10黃)中,置于37℃,5%CO2饱和湿度的孵箱内培养72 h更换培养液,弃掉未贴壁细胞,以后每3 d换液一次。细胞长到80%融合时用0125%的胰酶消化传代,以80103个细胞/cm2的密度接种于传代培养瓶中进行扩增培养，通过及时、反复传代对细胞进行纯化。
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　　123骨髓间充质干细胞的标记参照文献〔4〕。将第6代骨髓间充质干细胞培养48～72 h后，加入用胶体金(2倍浓度正常培养液加等量胶体金溶液)6 h标记细胞。更换胶体金标记培养液继续培养12～16 h，电镜检查其形态及标记率。4 C7 F; d$ Q4 U/ l6 R3 m

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　　124AMI模型制备大鼠腹腔麻醉后,仰卧位固定,气管插管,人工呼吸,应用BL420 E生物机能实验系统行心电监测,左胸纵切口分层开胸,在肺动脉圆锥和左心耳之间,距左冠状动脉起始2 mm处穿50号无创伤丝线,结扎该段冠状动脉。结扎后可见左室前壁失去原有光泽,变苍白,并出现搏动减弱,心电监测可见肢体导联Ｒ波振幅明显升高,随后出现Ｉ、avL导联ST段明显抬高,证实制作AMI模型成功。

　　125骨髓间充质干细胞移植大鼠心梗模型制备成功后，待大鼠呼吸平稳，直视下在梗死心肌周围用微量注射器分4点植入胶体金标记的rMSC(5106个细胞/100 μl);此步骤需动作轻柔，避免细胞外溢。将心脏放回，排气，肌肉、皮肤依次缝合，迅速关胸。在手术之中需给予呼吸机及氧气支持，在大鼠恢复自主呼吸后，撤掉呼吸机，30 min后再撤掉氧气。大鼠在移植手术前3 h需注射抗排斥药物环胞菌素A(河北医科大学海森生物公司)5 mg·kg-1·d-1，以后需每天注射，直到杀死。大鼠术后1 w内给予青霉素20万U/d防止感染(华北制药股份有限公司)。AMI干细胞移植 GCSF动员组及单纯CSF组分别在细胞移植前3 d及移植后5 d给予GCSF 30 μg/(ｋｇ·ｄ)剂量皮下注射。实验大鼠干细胞移植后情况：有40只大鼠生存到实验结束,各组分别剩余14、11、10、5只。死亡30只,原因为AMI后1 w内因心肌梗死并发症或灌胃误入气管致吸入性肺炎而死亡。
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　　126检测指标4 w后处死各组大鼠，取出心脏，将梗死区、边缘区及正常心肌组织块分别用10%甲醛固定,乙醇脱水,石蜡包埋。HE染色观察细胞形态特征及细胞排列方向等。免疫组化染色检测抗体PCNA、myogenin、myosin、Cx43及desinmim在移植骨髓间充质干细胞中的表达，并用共聚焦免疫荧光双标染色方法标测PCNA、myogenin。其中PCNA阳性为绿色，myogenin阳性为红色。以鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体作为第一抗体进行免疫组织化学检测。每个切片在心肌梗死区及其周围任取5个视野(400)计数血管数目,累计后取平均值作为每个视野的血管密度值。( ?- m8 y5 b# w1 `, B) B1 s, S

　　13统计学处理实验数据用x±s表示采用stata70统计软件进行统计分析,组间及组内比较均采用t检验。

　　2结果8 h! \/ X! \: n- t* J9 `, [7 R
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　　21骨髓干细胞形态及超微结构分离纯化并诱导的骨髓干细胞为圆形，细胞核清晰，72 h后部分细胞贴壁，部分为圆形，部分伸展为梭形(图1)，而后逐渐都变为梭形细胞；7 ｄ后出现较大克隆,第12天骨髓干细胞生长达80%～90%融合,其形态呈较均一的长梭形,细胞生长出现方向性，每瓶单层融合的MSC用胰蛋白酶消化后平均获得(50±021)105个MSC,将这些细胞再传代培养,达70%～80%融合时反复及时传代扩增,显示6代细胞形态呈均一的长梭形(图2)，经扩增16代后可获得(40±036)1012个细胞扩增约(68±045)106倍。  z9 Y& m" Z4 M: L+ w8 ?! [3 X
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　　22胶体金标记结果GCSF动员骨髓干细胞移植组心肌梗死区胶体金标记的骨髓间充质干细胞移植到心肌内后，与宿主心肌生长为一体，在移植部位颜色变黑(图3)，在HE切片中移植细胞的胞浆呈现紫红色(图4)。有的细胞中有胶体金颗粒。电镜下移植细胞内可见大量单位膜包裹的胶体金颗粒，标记清晰，容易识别。骨髓干细胞移植组仅梗死区边缘可见极少点状部位颜色变黑。" j8 t: P. ?5 S
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　　23心脏血管密度检测结果血管密度检测结果显示，GCSF动员骨髓干细胞移植组心肌梗死区血管密度为(422±65)(图5)，MSC组为(125±20)，GCSF组为(48±6)，对照组为(22±8)。GCSF动员 MSC组和单纯MSC组明显高于GCSF组及对照组(P＜001)，且GCSF动员 MSC组明显高于MSC组(P＜001)。

　　图1为原代培养72 h的rMSC形态 (200)（略）
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　　图2扩增培养第6代rMSC形态(200) （略）

　　图3骨髓间充质干细胞移植到心脏内在梗死部位与心肌生长为一体，颜色为黑色（略）4 l1 `; u0 s, o4 Y  a1 k

　　图4HE染色移植细胞为紫红色，与心肌细胞区别明显(400) （略）
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　　图5GCSF动员骨髓干细胞移植组心肌梗死区血管密度(400)（略）7 F* U0 M  u7 m7 l4 i2 O7 Q* f0 G
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　　图6GCSF 干细胞移植组移植细胞Cx43在移植细胞连接部位表达(400)（略）
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　　图7共聚焦免疫荧光双标染色观察结果(200)（略）+ g+ a7 E! \' x# l0 x! d0 @0 X9 }

　　24GCSF动员骨髓干细胞移植组心肌梗死区PCNA免疫组化结果在移植部位有较多的PCNA阳性细胞。骨髓干细胞移植组PCNA阳性细胞数减少。

　　25myogenin、myosin免疫组化结果GCSF动员骨髓干细胞移植组在移植部位有较多的myogenin阳性细胞,并出现胞质myosin阳性的细胞。骨髓干细胞移植组仅可见在移植部位个别移植细胞表达myogenin。

　　26desmin、Cx43免疫组化结果GCSF动员骨髓干细胞移植组desmin在移植部位的表达明显，并可见阳性细胞出现明显的横纹。Cx43在正常心肌细胞连接部位表达明显，在移植细胞处表达明显(图6)，其他组无表达。共聚焦免疫荧光双标染色观察结果：移植5 w后，PCNA、myogenin双标的细胞较多，PCNA阳性为绿色，myogenin阳性为红色(图7)。

　　3讨论! g" C" h8 h! \; S( i
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　　骨髓细胞移植在治疗急性心肌梗死(AMI)方面已表现出巨大的潜力和诱人的前景。其目前存在两大热点：(1)如何增加干细胞的驻留和存活的问题，以及移植后的分化及其是否具有心肌细胞特性(收缩耦联/电生理学特性)。(2)干细胞的微环境对其的影响问题，包括各种因子对增加骨髓干细胞存活和驻留的作用机制及对血管生成的影响〔1，2〕。但其移植细胞标记问题一直是困绕人们的难题之一。本课题将胶体金标记后的骨髓间充质干细胞移植到正常心肌组织内，结果表明移植细胞可以在宿主心肌中生长并使移植部位颜色变黑，使我们能够快速找到移植位点。移植细胞在HE染色切片中胞质为紫红色，与宿主心肌的粉红色区别明显。在超微结构观察中，用寻找胞质中有无胶体金颗粒的方法观察到不同分化状态的移植细胞，显示了跟踪移植细胞超微结构改变时用胶体金标记法的优越性〔4〕。5 `+ l4 r  j5 K

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　　选择心梗后不同时间进行移植可能会影响移植效果。目前文献中采用的移植时间为心梗后立即进行细胞移植及心梗7～15 d之后进行细胞移植，如果心梗后立即移植，由于炎症反应较强，移植细胞容易死亡，而在心梗7～15 d之后，炎症反应减弱，开始形成疤痕组织但又没有完全形成，舒张功能改变与急性心梗后病人心脏功能改变相似，此时移植细胞容易成活，与临床也比较接近，但两次手术增加了实验难度。本实验在心梗后立刻将骨髓间充质干细胞移植到心梗部位，用GCSF使骨髓干细胞向心肌损伤灶归巢，并采用移植大数量细胞来弥补炎症反应可能造成的细胞死亡，结果证实此方法可行。

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　　移植细胞的成活率问题是细胞移植中的关键性问题。Qu〔5〕等报道骨髓基质干细胞移植后48 h内大量死亡，有的高达95%，这可能与免疫反应、炎症反应有关〔6〕。GCSF是骨髓干细胞强有力的动员剂，应用GCSF是使骨髓干细胞向心肌损伤灶归巢和进一步分化的基础〔7〕。Hyosoo〔8〕等对心肌梗死患者给予GCSF动员的外周血干细胞治疗，结果显示干细胞治疗组的低灌注区减少，冠状动脉血流储备增加，心脏功能改善，但具体机理缺乏病理证实。在本研究中我们发现,结果证明动员干细胞治疗非常有效，极大的抑制了移植细胞死亡。移植细胞大量成活，分化形成大移植片替代瘢痕组织，改善心脏功能，才能达到我们研究的真正目的。

　　大量的实验提示骨髓干细胞的最终分化趋势取决于所处的微环境而不是其DNA编码。微环境的作用是使干细胞的静止基因活化，从而产生所谓的干细胞跨系分化。已有研究表明〔9〕，将血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因转入骨髓基质干细胞，将表达VEGF的骨髓间充质干细胞移植到急性心梗部位可增强血管新生能力，减小瘢痕范围，明显改善心功能。本研究结果表明分化状态较好的移植细胞旁常伴有血管的存在，说明移植细胞的生长需要血供的支持，改善移植细胞周围的环境可能会有助于其生长分化，这与GCSF刺激心肌梗死区域血管增生有关。这说明GCSF改善心肌梗死后心脏功能,与其动员骨髓干细胞归巢至梗死区,参与血管新生有关。* E0 D+ y: S$ K* F) X
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　　实验分别用4种抗体检测了骨髓间充质干细胞植入后的生长分化状态。结果表明我们将胶体金标记的骨髓间充质干细胞经GCSF细胞诱导归巢移植到大鼠梗死心肌中后，骨髓间充质干细胞大量成活，增殖旺盛，可见大量分化的肌管及增殖细胞，超微结构显示移植细胞经历了从单个骨髓间充质干细胞增殖分化成心肌纤维的生长过程。在心肌纤维中有大量肌原纤维沿细胞长轴排列，可见典型的心肌细胞结构，说明移植细胞可发育为成熟的心肌细胞。& L1 W& }% }. i) g2 X; a

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　　在移植细胞与宿主心肌是否能够产生缝管连接这个问题上目前的研究结果存在争议〔11〕。心肌细胞之间通过闰盘互相连接，闰盘中的缝管连接(主要成分Cx43)和黏附蛋白(NCadherin)分别负责电及机械的连接，其中缝管连接在心脏功能中起着重要的作用〔12〕。Taylor等〔13〕报道骨髓间充质干细胞移植到体内后心脏功能明显改善，移植细胞转分化为具有心肌细胞表型的细胞，这些细胞与宿主心肌之间以闰盘相连，文献也有类似报道〔14，15〕。与此结果相反的报道则表明在移植的骨髓间充质干细胞与宿主心肌之间始终未发现闰盘连接发育〔15〕，我们的结果与第一结果相一致，这说明移植细胞可分化为心肌细胞，与宿主心肌细胞产生电的连接，移植片与心肌同步收缩，不大可能会导致心率失常。最近的研究表明〔17〕过量表达Cx43基因的骨髓间充质干细胞呈现较强的肌源性分化能力，和其他细胞连接的能力也明显增强，提示选用高量表达Cx43的骨髓间充质干细胞会增加其与心肌细胞同步收缩的可能性，这也许有助于移植后心功能的改善。1 J* S% e4 Q+ b0 o1 _: x
      【参考文献】
目的  运用粒细胞集落刺激因子诱导骨髓间充质干细胞(MSC)移植归巢到急性心梗区域，研究不同环境下MSC在心肌内的分化状态及程度。方法  选用SD雄性大鼠，体重200～250 g，随机分为4组:急性心肌梗死(AMI)干细胞移植粒细胞集落刺激因子(GCSF)动员组(20只)、AMI干细胞移植组(20只)以及单纯GCSF组(20只)以及单纯对照组(10只)。于治疗4 w后取材，检测心肌梗死区及其周围的血管密度值。免疫组化染色检测抗体增殖细胞核抗原(PCNA)、肌浆蛋白(myogenin)、肌球蛋白(myosin)、缝管连接蛋白43(Cx43)及结蛋白(desinmim)在移植骨髓间充质干细胞中的表达。并用共聚焦免疫荧光双标染色方法标测PCNA、myogenin。结果  胶体金标记的MSC经GCSF诱导移植到心脏内在梗死部位与心肌生长为一体，颜色为黑色，在HE切片中移植细胞的胞浆呈现紫红色，极易识别。血管密度检测结果显示GCSF MSC移植组心肌梗死区血管密度明显高于其他各组。免疫组化染色检测抗体PCNA、myogenin、myosin、Cx43及desinmim在GCSF MSC移植组心肌梗死区中的表达明显。其他各组未见明显表达。结论 GCSF能够明显动员MSC归巢,促进梗死区血管新生，在梗死区分化成新的心肌。

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