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作者：柳浩然 杨长虹 高俊玮 薄巍巍 吴海权 伍军 陈风华 方加作者单位：1. 中南大学湘雅医院神经外科 湖南长沙 410008；2. 广东公安边防总队医院神经外科 广东深圳 518029 ) M- n' }# X9 \; l3 Z0 G
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# F1 y( k- Y0 b$ S 【摘要】 目的 探讨神经干细胞 （NSC） 移植入视神经损伤 （ONI） 的SD大鼠玻璃体下腔后在视网膜内表达脑源性神经营养因子 （BDNF） 的情况，为进一步探索NSC移植治疗视神经损伤提供实验依据。 方法 体外培养NSC，其上清液采用酶联免疫吸附实验 （ELISA） 定量分析BDNF含量。取34只SD大鼠，其中4只作为正常对照，另外30只制作成右眼ONI模型并随机等分为N组和P组。ONI术后随即向N组大鼠右眼玻璃体下腔注入定量NSC，P组注入等量PBS，并采用半定量RT-PCR方法检测正常大鼠视网膜及N组、P组大鼠术后第3天、1周、2周、3周、4周时视网膜BDNF mRNA的表达水平，行统计学分析。 结果 正常视网膜内可见BDNF表达；N组与P组大鼠视网膜内表达BDNF的量除第1周差异无统计学意义外，余时间段N组均高于P组。 结论 NSC能促使视神经损伤大鼠视网膜高表达BDNF，NSC移植治疗视神经损伤值得进一步深入研究。
" J4 D5 B: D: M* Q 【关键词】干细胞移植； 视神经损伤； 脑源性神经营养因子7 W- W0 L" |8 v- a" O0 Z
Expression of BDNF after neural stem cell transplantation in the retina
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of the Sprague-Dawley rats with optic nerve injury
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LIU Haoran1,2, YANG Changhong1, GAO Junwei2, et al
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1. Department of Neurosurgery, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, China;2. Department of Neurosurgery, Hospital for Guangdong Frontier General Team, Chinese People's Armed Police Forces, Shenzhen, 518029, China6 A" O, G w7 d, [3 I8 a
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Abstract:ObjectiveTo explore the expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the retina after transplantation of neural stem cells (NSCs) into the inferior vitreous cavity of the Sprague-Dawley (SD) rats with optic nerve injury (ONI), and provide experimental evidence for NSCs transplantation therapy for ONI.MethodsAt first, NSCs was cultured in vitro, and the supernatant liquid was detected of the BDNF by ELISA quantitative analysis. Secondly, thirty-four SD rats were divided into normal control group with 4 rats, and groups N and P with 15 rats each. Immediately after ONI, cultured NSCs were injected into the right vitreous body in Group N rats and the same dose of PBS was injected into the right vitreous in group P rats. Semi-quantitative RT-PCR was used to detect mRNA expression of BDNF in the normal retinas and retinas 3 days, 1 week, 2, 3 and 4 weeks after the operation in groups N and P, with 3 rats each time in every group. The data were analyzed statistically.ResultsThe expression of BDNF mRNA was observed in normal retinas. The expression level of BDNF mRNA in group N was almost all higher than that in group P in every time period, except the first week with no statistic difference.ConclusionNSCs transplanted in retinas of ONI rats can secrete large quantities of BDNF. It is worth deep exploring NSCs transplantation therapy for ONI.* Q4 W. X9 r8 h3 S- T& {3 J" L: W8 y
% T5 R& K! w: w. B2 q1 oKey words:stem cells transplantion;optic nerve injury;brain-derived neurotrophic factor视神经损伤后通常很难再生，其原因与神经所在微环境缺乏足够的神经营养因子，使视网膜节细胞 （RGC） 轴突再生困难密切相关[1]。脑源性神经营养因子 （BDNF） 是神经营养因子的重要成员之一，近年来的研究表明：BDNF对于RGC的生长发育及损伤再生等具有重要的作用[2]。神经干细胞 （NSC） 移植治疗脊髓损伤的研究已经取得令人鼓舞的进展，Lu等[3]研究发现：NSC移植入脊髓损伤动物模型后可分泌各种营养因子，如胶质细胞源神经营养因子 （GDNF）、BDNF、神经生长因子 （NGF） 等，并认为其是NSC促进损伤脊髓轴突再生的主要机制之一。NSC移植入大鼠视网膜后可否分泌神经营养因子尚未见报道，为此，本实验对移植后视网膜表达BDNF的情况进行探讨。
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1材料与方法+ X1 [# g s& f. `6 q
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1.1实验动物及分组成年SD大鼠34只，月龄2～3个月，雌雄不限，体质量300～350 g。4只作为正常鼠，其中2只作为N组 （干细胞移植组） 的正常对照，另2只作为P组 （PBS注射组） 的正常对照；其余30只按随机数字表法分为15只N组和15只P组，两组均使用精确校准方法制作部分视神经损伤 （ONI） 模型。N组在ONI术后随即向损伤眼玻璃体内注入定量NSC，P组则注入等体积PBS。分别于治疗后3 d、1周、2周、3周、4周 （每个时间段3只大鼠） 检测BDNF mRNA在视网膜内的表达水平。1 N5 x3 ^8 n! E& c8 @0 Z
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1.2胚胎神经干细胞分离及体外细胞培养[4]& Q$ C! S0 r; I4 `: c% V4 J
7 A' Q L3 x! d+ O/ u ?1.3体外培养NSC分泌BDNF蛋白的定量检测
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在DMEM/F12完全培养液 （DMEM/F12，谷氨酸盐2 mmol/L，2% B27，碱性成纤维细胞生长因子10 mg/L，表皮生长因子20 mg/L，无血清） 中培养NSC。37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 d后，NSC形成神经球，在培养液中呈悬浮生长，用吸管轻柔吹打球形克隆成为单细胞悬液。取1 ml NSC细胞悬液计数，计算浓度 （ 106/ml），2 000 r/min 离心15 min，取上清液，制备成样本液，4 ℃冰箱保存备用。另取部分培养的球形克隆悬液种植于多聚赖氨酸包被盖玻片的6孔培养板中，更换为去除生长因子和血清浓度为10%的DMEM/F12培养液，置37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养，7 d后观察到NSC被诱导分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。取1 ml分化后的NSC细胞悬液计数，制备样本液方法同上，预实验估计样本因子含量，稀释至适当浓度，随后行上清液BDNF蛋白酶联色疫吸附实验 （ELISA） 定量检测 （试剂盒购自Promega公司），流程及分析按试剂盒说明书操作。3 Y* `8 m; E! Z, [4 M( m7 E
) G7 C7 t6 z' _& Y1.4标定性视神经压榨伤模型制作3%戊巴比妥钠液 （30 mg/kg） 腹腔注射麻醉大鼠。剪除右眼睑附近手术区的毛发，沿眼睑外周弧形切口切开皮肤和球结膜，暴露分离上直肌，沿上直肌方向钝性分离筋膜，暴露视神经，剥离器拉开上直肌，显微镊向外侧牵引眼球，注意用力适宜，分离视神经周围包膜和筋膜，充分显露视神经。用视神经夹在球后2 mm处从眼球上方垂直视神经方向夹持视神经6 s，可见瞳孔逐渐散大，分层缝合结膜及眼睑。
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" R0 X8 p- u0 w1.5细胞移植收集神经干细胞球，用D-Hank液洗3次后移至0.5 ml的EP管内，再次离心后去上清，加入DMEM/F12基础培养液 （不含生长因子） 重悬细胞，调整细胞浓度为5 104个/μl，移植前置于冰上保护。3%戊巴比妥钠 （30 mg/kg） 腹腔注射麻醉大鼠，在手术显微镜下，将微玻管从大鼠右侧眼球的巩膜角膜缘处插入玻璃体腔内，抽出约1.5 μl玻璃体液，随即缓慢注入相同剂量NSC悬液；P组则注射等量PBS。! A& H, [' l4 o3 N- E- u; n
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1.6组织准备分别于移植实验后3 d及1、2、3、4周处死动物，摘除有视神经损伤的眼球，小心去除角膜、晶状体，获得视网膜组织，取约100 mg置于玻璃匀浆器中，提取RNA。; r F6 _! \9 K/ e
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1.7BDNF mRNA测定采用半定量RT-PCR 方法。用Trizol试剂盒提取RNA，逆转录成cDNA，产物保存于－20 ℃备用。根据GenBank检索大鼠BDNF基因序列，序列号是NM_012513，利用primer premier 5.0 软件自行设计，内参使用真核细胞中表达稳定且含量丰富的3-磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH） 基因。BDNF上游引物：5'-CAG TAT TAG CGA GTG GGT CA-3'，下游引物：5'-CCG AAC ATA CGA TTG GGT-3'，产物223 bp；GAPDH上游引物：5'-AACAAGCAACTGTCCCTGAGC-3'，下游引物：5'-GTAGACAGAAGGTGGCACAGA-3'，产物451 bp。PCR扩增：BDNF反应条件为95 ℃变性3 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，循环28次，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存；GAPDH反应条件为94 ℃变性3 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s；72 ℃延伸30 s，循环25次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。上述RT-PCR产物用2% 琼脂糖凝胶电泳。凝胶在紫外灯下观察，即时成像相机拍照。利用计算机辅助的图像分析仪扫描，进行定量分析，用BDNF与GAPDH的比值表示BDNF mRNA的相对含量。
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* w4 h! L, b% Z: \5 w# ~1.8统计学分析使用SPSS10.0 统计软件，样本均数采用x ± s表示，BDNF mRNA在视网膜内的表达同时间亚组间比较采用两独立样本均数t检验。 f: { V+ e6 n
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2结果: N& G/ H" q9 F8 m! M5 q# E h
, S G h6 C) M% a+ R0 D2.1BDNF在体外培养神经干细胞中的表达ELISA蛋白定量检测显示：在完全培养液 （无血清） 中培养4 d的未分化NSC分泌BDNF （9.1 ± 0.5） pg/1 106个细胞，在血清浓度为10%、去除生长因子的DMEM/F12培养液培养7 d后分化的NSC可分泌BDNF （17.9 ± 0.6） pg/1 106。经t检验，NSC分化前后分泌BDNF差异有统计学意义，P
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) Y: @/ ?5 C9 g$ ]% i2.2BDNF在视神经损伤大鼠视网膜内的表达 （表1）由于PBS对视网膜无明显影响，故PBS注射组 （P组） 的BDNF表达变化实际上是视神经损伤后机体自身的反应。视神经损伤后1周，BDNF在视网膜内表达升至高峰，随后逐渐下降，第4周时已低于正常水平 （图1A）。而移植NSC后，BDNF表达一直呈上升趋势，特别是在2周后，升高更加明显 （图1B）。经t检验，BDNF mRNA相对含量除第1周时N组与P组相比差异无统计学意义外，余时间段N组均高于P组，且差异有统计学意义。( A5 r* c5 k, b! {
+ H, V$ l ~- d, x+ ~ 3讨论
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e$ i9 D+ F2 B; b4 r自人们发现BDNF对视网膜节细胞有促进细胞存活及轴突再生的作用后，不断有学者试图直接注射BDNF或转染BDNF基因的腺病毒等来治疗视神经损伤，但前者由于注射不方便且持续时间短暂，不能有效挽救节细胞凋亡的命运[5]；后者可引起免疫反应，限制了其实际应用。因此，探讨NSC是否可在视神经损伤大鼠视网膜内持续表达BDNF，可为视神经损伤的治疗提供新思路。+ h' w; x3 m9 i2 C' P
+ r8 Y$ Y- ?$ v: ]; @ c本实验通过设立PBS对照组，进行表达量差值比较，发现BDNF分泌量除第1周与对照组差异无统计学意义，其他时间段均高于对照组。BDNF在NSC移植后第3天开始分泌明显高于P组，并呈上升趋势。由于P组反应的是视神经损伤后机体自身表达BDNF的变化，因此该实验结果提示：NSC移植入视网膜后，在4周内仍可持续表达BDNF mRNA。Ryu等[6]研究发现：人NSC移植入帕金森大鼠动物模型的纹状体后，在移植部位周围有BDNF表达，且双标免疫荧光示胶质纤维酸性蛋白 （GFAP，神经胶质细胞的标记物） 标记阳性的已分化NSC表达BDNF增多。结合本实验，提示NSC移植入视神经损伤的玻璃体下腔后，可能有较多细胞分化为胶质细胞，这一点还有待形态学研究来加以验证。这一发现可能对于NSC移植的远期疗效具有重要的临床意义。9 b$ V2 _2 {7 i% m0 ~1 u( F3 j
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Gao等[7]研究发现：视神经损伤后BDNF mRNA 在受损48 h内达到高峰，之后逐渐下降至基线水平；且进一步实验发现，是视网膜节细胞 （RGC） 自身而不是Muller细胞上调了BDNF的表达。Chidlow等[8]发现：BDNF在视神经受损72 h内达到高峰，到第7天时已有部分减低。本研究发现：BDNF在视神经损伤第1周时达到最高水平，之后逐渐降低；亦表明视神经损伤后短时间内，内源性BDNF可应激性升高，其可能是机体自身的一种保护机制，可部分减缓节细胞的凋亡。但这一反应持续时间较短，尚不足以阻止节细胞凋亡。体外注射BDNF仅可短暂延缓节细胞凋亡的过程，与生理过程有类似之处。
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: }0 w6 i* Z( f总之，本实验证实了视神经损伤SD大鼠玻璃体下腔移植NSC后，在4周内可持续表达BDNF，而后者已被研究证实对视网膜节细胞有促进细胞存活及损伤轴突再生的作用。这一发现提示：NSC移植治疗视神经损伤可能前景广阔，值得进一步深入探讨。
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