脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响 - 国内文献区干细胞之家



免疫细胞治疗专区	欢迎关注干细胞微信公众号

12 3 4 5 6 7 8 9 10 ... 24 下一页

返回列表

查看: 540382\|回复: 235	go 脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响 [复制链接]

文献管理员

版主

Rank: 7 Rank: 7 Rank: 7

积分: 8
威望: 8
包包: 898

楼主

发表于 2009-3-3 12:30 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：周娅蕾，罗二平，申广浩，吴小明，谢康宁，闫志伟作者单位：第四军医大学：1生物医学工程系军队卫生装备与计量学教研室 2口腔医院口腔颌面外科，陕西西安 710033


      ; j9 C0 |% F: s




                     % K0 @- l$ q5 ^+ l* \, [) t) s- Y
                  - r) b4 ~" i+ |* e: k0 r2 |2 l8 g



      % ]7 `+ ?/ R& U, @
      8 F' l; `' w, q
      【摘要】  目的：探讨脉冲电磁场（PEMFs)对大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）的影响. 方法：用全骨髓贴壁法分离rMSCs，对其进行1 Hz和15 Hz的PEMFs刺激，MTT法测定细胞增殖水平，检测碱性磷酸酶活性，进行四环素荧光染色和钙结节染色. 结果：rMSCs经PEMFs刺激后，各实验组细胞增殖水平均有不同程度提高，差异具有统计学意义（P
      【关键词】脉冲电磁场；骨髓间充质干细胞；增殖；成骨细胞  z1 {! c) Q' D# I/ F
   　　0引言7 j1 S0 H) K8 f5 V

　　骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于骨髓基质系统中，具有自我更新能力和多向分化潜能，免疫原性弱［1-3］. 脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields，PEMFs) 能够促进活细胞增殖及分化，刺激骨局部因子的产生，改善骨密度和生物力学特性［4］，用于骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病［5］. 近年来，国内学者在这方面开始了大量研究工作，认为MSCs经12 Hz，1.1 mT的PEMFs合理刺激后，细胞增殖加速，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性［6］. 利用恒磁场作用于骨组织中细胞，发现恒磁场处理可以促进MSCs向成骨方向分化［7］. 本实验通过观察rMSCs在低频率PEMFs的作用下增殖水平变化和细胞分化情况，以了解不同参数的PEMFs对rMSCs产生的影响.# N# B8 X6 M! [! O
/ ^% e& x/ m. l0 o
　　1材料和方法

　　1.1材料

　　SD仔鼠，12～15 d，体质量30～35 g，第四军医大学实验动物中心提供. 骨愈合刺激仪（第四军医大学生物医学工程系研制，ZL.0224739.4），治疗频率为15 Hz和1 Hz. 低糖DMEM（美国Hyclone公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；胰蛋白酶，茜素红S（美国Sigma公司）；盐酸四环素胶囊（西安利君制药股份有限公司）；碱性磷酸酶试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）.* r8 A  I; C) W7 _
; \( L" Z3 v: R) x$ c
　　1.2方法
" L& }, {8 [% e  f
　　1.2.1rMSC的体外分离培养- v7 y. u! Z: o' D& W" l

　　断颈处死大鼠，无菌条件下取其股骨和肱骨. 在PBS中将骨剪成1～2 mm3的小块，100目筛网过滤后移入离心管中，1200 rpm离心5 min，弃上清，重悬浮于4 mL低糖DMEM中. 72 h后换液.8 ~+ y7 n% ]7 G
( S5 b/ x$ i4 F0 V+ V
　　1.2.2rMSCs生物学特性鉴定
- F3 z# s3 [- q/ ^% g
　　进行PAS过碘酸雪夫氏染色、油红O染色和碱性磷酸酶（ALP）染色.

　　1.2.3rMSCs生长曲线的绘制, P% _, O0 r' S4 W
, }# e( ?  u/ q
　　将原代细胞以5106 cells/孔接种在24孔板上，第4日开始，每日消化3个孔，分别计数，求平均值绘制生长曲线. 将第3代细胞以1104 cells/孔接种在24孔板上，第2日开始以同上方法绘制生长曲线.

　　1.2.4刺激方法  U! y& \9 Y, `
& B; [) Y/ l. g$ \. b( U0 d$ f
　　PEMFs发生仪频率：15 Hz，1 Hz；磁感应强度：0～0.8 mT可调；线圈直径：200 mm. 调整两线圈距离至100 mm. 将线圈放置在孵箱中，刺激时将细胞放置在两线圈中间位置. 调整需要的强度和频率，刺激结束后，将对照组放在同样位置相同时间. 刺激时间为每次3 h，1次/d.+ Q& R2 D8 g0 N  j! r3 \0 R

　　1.2.5MTT法检测

　　细胞增殖将rMSCs以1104 cells/mL接种于7个96孔板中，每板接种32孔. 刺激方式为：T0组(对照组)；T1组(15 Hz，0.2 mT)；T2组(15 Hz，0.4 mT)；T3组(15 Hz，0.8 mT)；T4组(1 Hz，0.2 mT)；T5组(1 Hz，0.4 mT)；T6组(1 Hz，0.8 mT)，连续作用5 d. 接种第2日开始PEMFs作用. 第3日每板选择16孔，加MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h，弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡10 min，测定490 nm波长时各孔的吸光度A值. 第5日对其余孔做同样检测.! x" M6 l" F' T8 X

　　1.2.6ALP活性检测( R' j9 f. R- n' V# V2 ^9 I7 g
' j2 X" ?$ W0 ?* Z3 G, |3 |
　　将rMSCs以每孔1104 cells/mL接种于6个24孔板中，每板接种8孔，分为2组，每组3个板. 刺激方式为：T0组(对照组)，T1组(1 Hz，0.4 mT). 接种第2日开始PEMFs刺激，连续刺激15 d. 第3日选两个板，测定ALP活性. 第5日和第15日各检测2个板.. @6 [; E: H2 b) J, _
9 I8 X- n7 |. u1 s0 r9 K, q  e
　　1.2.7四环素荧光标记" u4 \; \0 A$ r$ J+ C/ o9 I' L) C

　　将rMSCs以3104 cells/mL接种于2个6孔板中，分为对照组与实验组. 第2日开始对实验组进行PEMFs刺激，每天刺激结束后，关闭仪器电源，将对照组放在相同位置相同时间. 培养18 d后对细胞进行四环素荧光标记. 荧光显微镜下观察并采集图像.

　　1.2.8钙结节染色, U& ^' ~- m) m+ H6 Z
& M8 I; Q6 C% u& V$ I
　　将rMSCs以5104 cells/mL接种于2个6孔板中，分为对照组与实验组. 接种第2日开始PEMFs作用，对照组处理同前. 28 d后，用茜素红S染液进行钙结节染色. 倒置显微镜下观察并采集图像.
& F' F1 K4 T1 R  w
　　

　　统计学处理：数据以x±s表示，应用SPSS 12.0统计软件进行分析，采用SNKq检验和方差分析. 以P% u) l- |" N0 M9 L& z, z

　　2结果$ G4 `0 X( M4 L

　　2.1形态学观察及生物学鉴定" Y/ A0 r  U( b) m3 `+ @
' ^4 _$ N6 \9 e, ?6 n& L* u
　　接种前3 d可见大量大小不一，圆形悬浮细胞. 第5日大部分细胞呈成纤维细胞样，第7日后，可见梭形细胞，部分形成集落，排列呈规则的辐射状. 经2～3次纯化处理，细胞形态趋于单一化，以梭形、三角形为主，呈集落生长趋势（图1）. 染色结果均为阴性，说明细胞不能分泌糖原、未向脂肪细胞及成骨细胞分化.. W5 `0 ]5 |6 P6 R9 s
4 E3 P& d* |9 ?& N: D- w
　　2.2rMSCs生长曲线的绘制

　　细胞生长曲线呈“S”形，具有稳定的潜伏期、对数增长期和平台期. 可见传代细胞生长周期明显比原代细胞短（图2）.

　　2．3PEMFs对rMSCs增殖水平的影响

　　PEMFs刺激3 d后，T1，T2，T4与对照组A值分别为0.265±0.063，0.260±0.059，0.266±0.057和0.246±0.044，组间差异均无统计学意义（P>0.05）. T3，T5和T6组A值分别为0.288±0.060，0.323±0.051和0.300±0.042，与对照组相比差异均具有统计学意义（P. M6 g' S: m  s+ g8 X% N2 {
+ ^0 j9 x) m( N
　　2.4ALP活性检测经) E, ]. |* j5 Q; s& K: W

　　PEMFs刺激后，实验组与对照组A值3 d为0.225±0.017和0.185±0.025，差异无统计学意义（P>0.05）；5 d为0.348±0.032和0.205±0.026，差异具有统计学意义（P

　　2.5四环素荧光标记
/ _; y5 K9 t6 f4 f6 T+ L
　　细胞8 d左右呈梭形分布，并出现融合，约16 d左右出现结节状物. 继续培养可见复层生长. 持续培养，中心出现圆形细胞结节. 培养21 d时，尚无明显钙结节出现. 但四环素荧光标记后，镜下细胞周围基质聚集区呈明亮的黄色荧光区，阳性面积约占（10.1±1.2）%；对照组阳性面积约占（2.3±0.7）%. 两者之间差异具有统计学意义（P9 F* e3 d6 M* w$ `/ I
# O* w. k8 a8 E+ r: {4 [8 g' |
　　2.6钙结节染色结果* s3 o4 X, y( t% q  e1 q1 e, _7 F
$ K) i+ e$ W! [) l- R/ }% N4 E
　　持续培养32 d后进行钙结节染色，可见钙结节成橘红色，大小、形态各不相同，边界清晰，呈火山状突起，中间有黑色不透光颗粒，周围为橘红色，由中间向周边颜色逐渐变浅，阳性面积约占（15.3±0.6）%；对照组阳性面积约占（9.6±0.8）%. 两者之间有显著差异（P
/ e; |+ e. P3 L% S- A
　　3讨论
  h1 Q6 E6 B8 M- C( |+ g, P) g1 X
　　本实验采用全骨髓贴壁法，在冲洗骨髓腔时某些滋养细胞和细胞因子会同时被冲出，与MSCs一同培养，可促使MSCs生长增殖旺盛，活力相对较强. 目前该类方法通常采用的是成年大鼠，虽然成年大鼠可以获得较多的骨髓量，操作也相对方便，但成年大鼠体内MSCs的含量更少，增殖能力也较年幼的动物差，为此，我们采用了12～15 d的大鼠. 根据生长曲线，选取3～4 d的传代细胞用于实验. MTT实验结果显示T5组可以显著提高rMSCs增殖水平，提示该刺激参数可能是PEMFs刺激MSCs生长与增殖的一个“窗口”. 本实验中，PEMFs作用3 d后，T1，T2，T4组均未能表现出提高细胞增殖水平的作用，但在作用5 d后，各组细胞增殖水平均有提高，说明对于不同的频率和场强，细胞需要不同的刺激时间，才可以对PEMFs产生有效的反应. 倒置相差显微镜下观察到经PEMFs作用的rMSCs体积明显较对照组大，细胞增殖能力旺盛，传代周期明显缩短，培养2～3 d即可进行传代处理.
  L& S: I3 t& K2 V
　

　　PEMFs作用促进成骨细胞增殖、分化，加速了体外骨形成［8］. ALP是成骨细胞的早期标志酶，可标志成骨分化的开始. 有研究发现，MSCs向成骨细胞分化的过程中，ALP水平有时间依赖性，随着诱导时间的延长表达量增加［9］. 本实验结果显示，经过5 d的刺激， rMSCs中可检测到ALP的表达，并随时间延长，表达水平逐渐增高，说明rMSCs向成骨细胞分化，并开始分泌骨基质. PEMFs刺激18 d，四环素荧光标记可观察到相当数量和面积的特征性金黄色，进一步证实rMSCs向成骨细胞分化，并促进了成骨细胞的体外骨形成. 继续刺激，可肉眼观察到圆形或卵圆形的矿化小结，经茜素红染色为阳性，对照组也出现弱阳性反应. 可能的原因是由于培养液或血清的诱导，也可能是由于体外获取的原代细胞含有少量成骨细胞，rMSCs的分离方法还需要进一步改进.( y- H5 Y( N5 R4 g) `! ^1 Q. C
$ o& c% d+ E4 T' L  g% d
　　PEMFs有促进rMSCs增殖和成骨分化两方面的作用，是PEMFs有效治疗骨折、骨质疏松等骨科疾病的可能机制之一. 但是将PEMFs用于促进rMSCs增殖以获得大量组织工程种子细胞的时候，需要找到更好的磁场参数和培养条件，控制rMSCs的分化，这些都有待今后进一步深入探讨.  ?) t( I  r2 {! q! X
5 ^& p# A7 y2 M4 l
　- l; R* L9 ]2 S! X. u& k
      【参考文献】
　　［1］Sudeepta A,  Pittenger MF.  Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses ［J］.  Blood,  2005,  105（4）: 1815-1822.# |0 T, D' p" \
  n5 I# m3 p- L7 H/ e

　　［2］庞永刚, 崔彭城, 陈文弦, 等. 人骨髓间质干细胞作为骨、软骨组织工程种子细胞的实验研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志, 2004, 20(3): 306-309.! r/ C0 l7 o" g" ~% H# m

0 M$ o( J  p. K& `7 J2 e7 @& C( B; n
　　［3］曹丰，贾国良，牛丽丽，等.移植时机对骨髓间充质干细胞修复梗死心肌的影响［J］. 第四军医大学学报，2005，26（1）：22-27.

- s3 h. v" T, T5 Y1 ^4 A0 p) n
　　［4］罗二平，焦李成，申广浩，等. 不同强度脉冲电磁场对兔股骨骨密度及生物力学特性的影响［J］. 生物医学工程学杂志，2005，22（6）：1168-1170.

; E) O0 C. \! W* h2 A

　　［5］Simmons JW Jr, Mooney V, Thacker I. Pseudarthrosis after lumbar spine fusion: Nonoperative salvage with pulsed electromagnetic fields［J］.  Am J Orthop，2004, 33(1): 27-30.- @, f& T7 K6 U+ N  {4 {& Y$ `3 j
( y' v& b6 H& R: }; t. T

. R# y5 t! w* x9 y  j% m
　　［6］赵敏，许建中，周强，等. 脉冲电磁场促进人骨髓间充质干细胞成骨的研究［J］.中国矫形外科杂志, 2004，12(6):439-443.2 j- `" ^* N6 f) y
$ E9 U9 T8 ?" [& [4 e

　　［7］张小云，张宇. 恒定磁场对骨组织中细胞影响的研究［J］. 中国骨质疏松杂志，2006， 12（4）：333-337./ w2 P6 a0 ?, O. s& r$ D, A
5 M/ u, u' q: q: D* v# l& Z

　　［8］李丽荣，罗二平，申广浩，等.低强度脉冲电磁场对大鼠成骨细胞的影响［J］. 第四军医大学学报，2005，26（6）：571-573.9 h* f  M) a6 s0 L! {

3 T# J0 y% ?4 @4 R+ N# [: O* j
　　［9］Sammons J, Ahmed N, ElSheemy M，et al. The role of BMP6, IL6, and BMP4 in mesenchymal stem celldependent bone development: Effects on osteoblastic differentiation induced by parathyroid hormone and vitamin D3［J］.  Stem Cells Dev,  2004, 13(3): 273-280.

收藏0 分享0 顶0 踩0