Matrigel对羊水间充质干细胞成组织能力的影响 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:31 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：杜玉峰作者单位：上海交通大学医学院附属新华医院泌尿外科，上海 200092 8 J4 h% Q% o0 Z% U; C+ K% f: J
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      【摘要】  目的研究Matrigel对羊水间充质干细胞在裸鼠皮下成组织能力的影响。方法将羊水间充质干细胞与Matrigel混合，注入裸鼠皮下，14 d后观察新生物的形态外观和组织结构。并以不混合Matrigel的羊水间充质干细胞注入裸鼠皮下作为阴性对照，单纯Matrigel注入裸鼠皮下作为空白对照。结果实验组和阴性对照组在裸鼠皮下均形成一长圆形瘤样组织，其形态外观基本一致，但组织结构有明显差异，在实验组组织血供丰富，主要为腺样结构，部分含管腔，向平滑肌细胞，上皮细胞和幼稚神经细胞分化。在阴性对照组血供较少，细胞呈单一平铺排列，未观察到明显组织结构，细胞未分化。空白对照组无新生组织形成。结论 Matrigel能促使羊水间充质干细胞在裸鼠皮下向成熟的组织细胞分化并形成简单的腺样组织结构。
      【关键词】羊水间充质干细胞组织工程 Matrigel 细胞外基质( J: [# x6 w( h8 d


Effects of Matrigel on the Morphogenesis of Amniotic Fluidderived Mesenchymal Stem Cells in Vivo.DU Yufeng, GENG Hongquan, PAN Jun, ZHU Zhe, QI Jun, KANG Jian,XIE Hua, CHEN Fang.Space Medicine & Medical Engineering,2008,21(2):112～116! t7 ~% g( G  f5 y2 ~7 C" |; t
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Abstract: Objective To investigate the effect of Matrigel on the morphogenesis of amniotic fluidderived mesenchymal stem cells in vivo. Methods Amniotic fluidderived mesenchymal stem cells (MSC) were mixed with Matrigel, injected into nude mice. 14 d later, new subcutaneous tissues were harvested. Gross appearances and tissue structures were observed. Negative and blank controls were set up by nonMatrigel mixed amniotic fluidderived MSCs and Matrigel alone injected, respectively. Results Both the experimental group and the negative control group had subcutaneous tissues generated, though the gross appearances were similar, which were ellipseshaped tumor like tissues,but tissue structures were obvious different. In the experimental group, blood supplies were abundant,and glandlike structures were observed, some of which contained a lumen. There were differentiated smooth muscle cells, epithelial cells and early nerve cells distributed in tissues. In the negative control group, blood supplies were relatively rare, cells were simply tiled and remained undifferentiated, no special structures were observed. Matrigel was absorbed in blank control group. Conclusion Matrigel can promote the differentiation of amniotic fluidderived MSCs and form simple glandlike structures.

Key words：aminiotic fluidderived mesenchymal stem cells;tissue engineering;Matrigel;extracellular matrix

Address reprint requests to:CHEN Fang.Department of Urology,Xinhua Hospital, Medical School of Shanghai Jiao tong University,Shanghai 200092,China
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细胞外基质是组织器官的重要组成部分,具有结构支持功能和重要的生物学作用,如调节细胞形状、代谢、迁移、增殖和分化以及细胞功能，是正常组织器官形成和发育过程中不可缺少的成分。Matrigel［1］是从EHS（engelbrethholmswarm）小鼠肉瘤的可溶性基底膜抽提得到的细胞外基质复合物凝胶，其主要成分是层粘连蛋白、胶原蛋白Ⅳ、entactin、硫酸肝素糖蛋白、TGFβ、纤维母细胞生长因子、组织纤溶酶原激活物（tPA）和其他的一些细胞生长因子［1］。近年来，其在组织工程中的应用日益受到重视。Matrigel加入到细胞培养体系中，如乳腺细胞、内皮细胞、胚胎干细胞培养体系等，能促进细胞增殖、胶原分泌、组织成形、促进血管内皮细胞形成毛细管状结构［24］。从孕中期羊水获取的间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）是来源于中胚层组织的多能干细胞，具有向多种中胚层及神经外胚层衍生的组织细胞分化的能力，可以作为胎儿组织工程的种子细胞［5］，在将其植入PGA（聚乙醇酸）及无细胞基质支架材料后虽然能形成组织，但成组织过程缓慢，生长的组织结构形态单一，机械强度不高，将其应用于组织修补和重建的效果欠佳［67］。例如Julie等［7］曾应用羊水间充质干细胞行膈肌修补，但有一部分实验动物在修补后再次出现膈肌疝，说明新生成的组织并不完全可靠。为了优化羊水MSC的成组织能力，构建出理想的组织工程学脏器，本试验拟引入Matrigel，观察羊水MSC在有Matrigel存在的情况下的生长分化和成组织情况，探讨在有Matrigel存在的情况下是否获得更好的成组织效果及形成何种类型的组织结构，从而为胎儿组织工程器官重建和修复中Matrigel的应用提供实验依据。

方法+ c1 C1 k9 K- }: @: O

人孕中期羊水MSC为本试验室冻存［8］；Matrigel，丁酸钠（Sigma公司）；BALB/cA裸鼠（中科院上海试验动物中心）；腺病毒重组绿色荧光蛋白rAAV2/GFP（新基因公司）；F10、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶1 mmol EDTA（Gibco公司）。实验获得上海交通大学医学院附属新华医院道德伦理委员会批准。1 Y6 s* F1 E9 m

GFP转染MSC取液氮冻存的第三代（P3）羊水MSC复苏，37 ℃快速解冻1 min，制备成1 mL细胞悬液，血细胞计数板计数，按5104个细胞/孔接种入24 孔板，共接种8 孔，加入含10％FBS的F10培养液2 mL,置饱和湿度、37 ℃、5% CO2 培养箱培养12 h。12 h后镜下观察细胞已经贴壁，弃皿内培养液，用无血清的F10培养液冲洗2次。按105的MOI值(v.g./cell)将rAAV2/GFP 病毒与无血清的F10混合，以2 mL/孔分别加入24孔板培养皿。将24孔板置于培养箱培养。1 h后，吸去孔内培养液，每孔加入1 mL含10％FBS的F10和1 mL 50 mmol/L丁酸钠，以增强GFP表达。24 h后，在荧光显微镜下随机选取10个非重叠视野计数GFP阳性细胞，计算转染率。
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分组及裸鼠皮下种植取2 wk龄BALB/cA裸鼠9只，随机分为3组，每组3只，分别作为实验组，阴性对照组和空白对照组。取2皿形态良好生长旺盛达90％融合的GFP羊水MSC，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶1 mmoL EDTA 混合液37 ℃消化5 min，移入50 mL无菌离心管，1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入1.5 mL培养液（含10％FBS的F10）制成单细胞悬液，取3支1 mL针筒分别吸取约0.5 mL细胞悬液，注入裸鼠胁腹部或背部皮下，此为阴性对照组。同样方法取2皿GFP羊水MSC消化后加入另一50 mL离心管，1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入0.5 mL Matrigel和1 mL培养液（含10％FBS的F10），吹打混匀，制成悬液，然后取3支1 mL针筒分别吸取0.5 mL 混合有Matrigel的细胞悬液，注入实验组3只裸鼠背部皮下。最后单纯将0.5 mL Matrigel分别注入空白组3只裸鼠皮下。为防Matrigel凝固，所有操作均在冰上进行。( `9 s- q3 t- c5 x* S: \
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瘤样组织的获取和评价种植14 d后处死裸鼠并获取皮下新生组织，观察其形态外观。在荧光显微镜下观察GFP表达情况，确定新生组织的细胞来源并进行HE染色和CK,Nestin,aActin免疫组化染色。

结果/ I/ ]& e1 W' H) A( S; c' J  R
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形态外观羊水MSC植入14 d后，实验组和阴性对照组在裸鼠背部皮下均形成一突起，处死后沿突起一侧纵行切开，可见皮下有一新生瘤样组织，实验组和阴性对照组形态外观基本一致，呈长圆形，平均约1 cm0.5 cm0.5 cm大小，质软，表面光滑，色泽红润，与周围组织无粘连(图1)。荧光显微镜观察瘤样组织切片GFP呈阳性表达，证实该组织细胞来源于GFP标记的羊水MSC而非裸鼠自身组织（图2）。空白对照组裸鼠皮下Matrigel均被吸收，无瘤样组织形成。0 x# s4 K, z' t, I6 |
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HE染色对组织切片进行HE染色，在光学显微镜下观察，发现实验组和阴性对照组瘤样组织的组织结构有明显差异（图3）。含Matrigel的实验组的瘤样组织切片上可见较多血管切面，平均每个高倍视野可见2个以上，管径大小不一；组织内细胞呈局灶性分布，为被覆极化上皮的腺样结构，部分腺样结构有管腔形成。不含Matrigel的阴性对照组组织切片上少见血管切面，平均每个高倍视野偶见一个或者没有，管腔也较实验组更细小；组织内细胞形态单一，呈弥漫性分布，几乎见不到组织间隙，观察不到具体的组织结构如腺样结构、管腔结构、细胞聚集区等。

免疫组化染色CK,αactin和Nestin分别为上皮细胞，平滑肌细胞和幼稚神经细胞的特异性标志蛋白。为研究这些细胞在瘤样组织中是否存在及其分布情况，我们分别进行了上述蛋白的免疫组化染色（图4）。在含Matrigel的实验组，CK,αactin和Nestin蛋白免疫组化染色均呈阳性,但3种染色阳性细胞分布情况并不完全相同，Nestin染色阳性细胞主要局限于瘤样组织中央的一些区域，CK,αactin染色阳性细胞分布情况相似，主要分布于腺样结构的外周及腺样结构之间的间质区域，αactin阳性细胞在间质区域更多见，而CK染色阳性细胞除间质区域外在腺样结构周围区域也有相当分布。上述结果表明此瘤样组织存在上皮细胞，平滑肌细胞和幼稚神经细胞类型细胞的分化并按一定规律分布。而阴性对照组的CK,αactin和Nestin染色亦为阳性，但显示为弥漫性分布，与某些间叶性肉瘤和胎儿期间叶组织的免疫组化染色结果类似［9］，说明主要为尚未分化成熟的幼稚细胞。1 q, B. r/ ^4 r9 U9 g

讨论3 C& m4 k/ W" I* w' P$ N: e0 _" B
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随着对细胞外基质研究的深入，人们发现其在组织发生发育及细胞活动中起着重要的作用，如诱导及保持细胞极性，介导细胞黏附，促进细胞分化和组织形态发生，影响细胞迁移、增殖，抑制细胞凋亡等。这些功能的实现一方面是通过细胞外基质大分子成分的活性位点与细胞相互作用，另一方面则通过细胞外基质内贮藏的生长因子和图4(ac)分别为实验组CK、αActin、Nestin免疫组化染色(100)；(d)阴性对照组CK免疫组化染色(100)。αActin,、Nestin染色与图d所示类似细胞因子发挥作用［10］。鉴于细胞外基质在细胞活动中的重要意义，有研究开始将细胞外基质加入到各种细胞体内和体外培养的体系中。应用较早的是单一的细胞外基质成分，如层粘连蛋白1，胶原蛋白1［11］，这些单一细胞外基质成分与普通培养基相比能促进细胞增殖、生长的速度和分泌胶原蛋白的能力。后来从EHS小鼠肉瘤中提取到的Matrigel和从软骨基质中提取出来的Cartrigel都是含有多种成分的细胞外基质复合物。其主要成分除层粘连蛋白，胶原蛋白外，还含有氨基聚糖、生长因子等。这些细胞外基质复合物的成分更接近正常细胞生长的微环境，并为细胞生长提供生长因子，因此比单一细胞外基质成分更能发挥生物学作用，如促进细胞增殖、生长、分泌胶原的能力更强，此外还能促进细胞的分化、迁移、组织成形等。如乳腺上皮细胞在Matrigel中生成腺样、毛细导管样结构，并能向腺腔内分泌酪蛋白等功能性蛋白质［1213］。软骨细胞在Matrigel中培养后，有软骨结节形成［14］。上皮细胞则在Matrigel中黏附、排列、增殖后生成有管腔的毛细管状结构［15］。而在普通培养条件下这些细胞仅仅增殖而不发生分化或者分化不明显。细胞在Matrigel中能分化生成复杂的组织结构可能和细胞在传统培养基上只能二维贴壁生长，而在Matrigel中却能向三维立体空间方向延伸，而且Matrigel中富含具有生物活性的大分子成分和生长因子，与细胞接触后能调节细胞增殖和分化。

细胞外基质早在胚胎二细胞期开始形成，并和胚胎干细胞相互接触影响，因此细胞外基质可能对干细胞的分化和增殖有一定意义［12］。Deborah等［16］比较了恒河猴胚胎干细胞（RMES）在不加入细胞外基质成分时、加入单一细胞外基质成分如层粘连蛋白1或胶原蛋白Ⅰ时，以及加入细胞外基质复合物如Matrigel和Cartrigel时的生长和分化情况，并利用回转生物反应器(rotating wall vessel bioreactor， RWVB)模拟微重力环境加强培养细胞的三维增殖与分化。他们发现无论是普通培养环境还是RWVB培养环境中，RMES在无细胞外基质时仅形成单一平铺的细胞层，细胞处于未分化状态；加入单一细胞外基质成分的培养结果也与之类似，而加入Matrigel的细胞则形成许多明显的细胞聚集区，形成腺样结构，在RWVB培养体系中这种表现更加明显。生成腺样结构的具体机制尚不清楚，可能与细胞外基质富含血管生成因子和生长因子有关，这些因子在细胞分泌的蛋白酶的作用下释放并发挥作用，如层粘连蛋白1、胶原蛋白Ⅳ和其他细胞外基质蛋白都是成血管和细胞生长的信号分子。

羊水MSC是一种多能干细胞，具有向多种中胚层及神经外胚层衍生组织细胞分化的能力，在组织工程学器官重建和修复中具有广泛的前景［5］。本试验将转染GFP的羊水MSC与Matrigel混合，观察其在裸鼠皮下生长的结果，所得出的结果与Deborah等将RMES在体外与Matrigel混合培养的结果类似。在Matrigel存在的情况下，羊水MSC黏附于Matrigel并向三维空间方向增殖、分化，在分化的过程中细胞聚集形成细胞团并进一步分化形成由极化的上皮细胞包绕的腺样结构，部分有管腔形成，并且组织内还有许多血管结构，可能和Matrigel具有促血管生成的作用有关。进一步进行免疫组化染色发现组织内有平滑肌细胞，上皮细胞和幼稚神经细胞类型细胞的分化，这些细胞主要分布于腺样结构的外周和腺样结构之间的间质组织中。荧光显微镜证实这些细胞的确来源于GFP标记的羊水MSC，是羊水MSC向这3种细胞发生分化的结果。未混合Matrigel的羊水MSC在裸鼠皮下亦形成瘤样组织，但未观察到明显的组织结构形成。因此，Matrigel能促使羊水MSC在裸鼠皮下迅速增殖分化并形成具有一定组织形态结构的新生组织，在利用羊水MSC进行胎儿组织工程学重建或修补时可考虑加入Matrigel以增强成组织效果。2 W" a% T# N# X# V

结论" t. h( v; X/ H. @- [0 Y
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〖HT5SS]综上所述，Matrigel能促使羊水间充质干细胞在裸鼠皮下向成熟的组织细胞分化并形成简单的腺样组织结构。利用Matrigel具有三维空间结构及可以供生长因子等特点，如果能结合生物反应器模拟细胞生长的力学环境进行细胞培养和组织重建，将更符合细胞在生物体内的生长环境，从而达到理想的体内、体外培养条件，生成符合组织工程学要求的组织和器官。. m' Q: U5 e0 Z

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