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作者：郑东，杨述华，冯勇，杨操，李进，梅荣成，唐欣，徐亮作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，湖北 武汉 430022
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【摘要】 目的: 通过对骨髓基质干细胞（MSCs）的单克隆化培养、鉴定和扩增，获得从一个单细胞克隆扩增出的大量均质的MSCs，并通过对这种MSCs诱导分化的实验研究，进一步确定这种单克隆来源的MSCs的分化和“横向分化能力”. 方法：无菌条件下获取大鼠的骨髓细胞，将获得的细胞经过充分打匀和滤过后制成单细胞悬液，然后以低密度，1×103个细胞数接种于培养板中，待细胞出现单细胞生长的克隆后，通过显微操作挑出相应的单细胞克隆. 将挑出的单细胞克隆与相应的饲养细胞混合培养，快速进行扩增，扩增后的细胞进行细胞表面标志的鉴定，并进一步进行增殖和细胞分化实验. 结果：在含有特定饲养层细胞的培养条件下，单克隆来源的MSCs能在抑制分化的状态下进行大量扩增，并保持细胞的均质性；而且在这种培养条件下，MSCs的增殖能力明显的高于常规培养条件；同时，获得的这种均质MSCs能成功的被诱导向软骨，神经样细胞分化. 结论：通过骨髓细胞的单克隆培养，获得了均质和具有多向分化潜能的MSCs，这也为进 ［1］Forte G, Minieri M, Cossa P, et al. Hepatocyte growth factor effects on mesenchymal stem cells: proliferation, migration, and differentiation［J］. Stem Cells, 2006, 24(1):23-33.) c: ]) e: S' u; [6 G
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( O. |' k, C/ H1 s6 }1 m 【关键词】骨髓基质干细胞；克隆细胞；横向分化5 {3 q) {* R0 Z+ Q
An experimental study on monoclonal culture and differentiation of marrow stromal stem cells
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7 k/ A- \6 D4 f ZHENG Dong, YANG ShuHua, FENG Yong, YANG Cao, LI Jin, MEI RongCheng, TANG Xin, XU Liang
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1 t0 k5 S: ?/ h6 I7 X8 X1 b Department of Orthopedics, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China
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- I, m& h( E% z! E 【Abstract】 AIM: To obtain a large number of homogeneous marrow stromal stem cells (MSCs) by monoclonal culture, identification and proliferation of MSCs, and to investigate the differentiation and transdifferentiation potential of MSCs derived from the monoclone.METHODS: Single cell suspension was obtained after sufficient mixing and filtering of rat marrow cells and then seeded into culture plate at a low density (1103). Monoclonal cells were identified through microscope and were picked out with micromanipulative technique when these monoclones were obvious. Then these picked cells were cocultured with mouse embryonic fibroblasts as feeder cells which were treated with mytomycin for quick proliferation. The cells after proliferation were identified by means of cell surface markers. The monoclonal cells which contained the cell surface markers of MSCs were harvested and the potentials of proliferation and differentiation were explored further.RESULTS: MSCs derived from the monoclone proliferated markedly without differentiation when they were cocultured with feeder cells, and the proliferation was obviously quicker than that in the normal medium. At the same time such a coculture maintained the homogeneous property of monoclonal MSCs. In addition, the homogeneous MSCs had the potential to differentiate into chondrocytes and neuronal cells. CONCLUSION: MSCs derived from monoclone can be expanded massively when cocultured with feeder cells, and have the potential to differentiate into chondrocytes and neuronal cells, which lays a foundation for further investigation of the biological properties of MSCs.* D6 ^ h1 {% ?. D
; ]3 D0 a; D9 z; ]0 u 【Keywords】 marrow stromal stem cells; clone cells; transdifferentiation8 l. R) K, H. o2 ?5 c
[8 T. p' _- w! i; u, p* h6 K" g 0引言
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& {; H5 g3 T2 X. h& z# V6 E7 p 骨髓基质细胞（marrow stromal stem cells，MSCs）被认为是在生物工程领域中最具潜力的一种种子细胞，在骨软骨组织工程和神经细胞等的修复中都具有广泛的应用，甚至还有研究表明MSCs还可以分化成肝细胞和胰岛样细胞［1-2］. 但是我们对这种细胞本身的研究却不是很完善，本实验我们通过对单克隆来源的MSCs进行扩增和鉴定，获得大量均质的单一细胞来源的MSCs，并在此基础上进行单克隆来源的MSCs分化的初步实验研究，证明这种成体干细胞的分化和横向分化能力.* c$ G, c2 o6 [% ?! X
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1材料和方法6 [# Z, W# |. R, x
6 o; ^+ N8 `) _& n& Y! i: | 1．1材料+ ^: J. K, ]; w/ X$ c
& z+ k! r( F* ~: v 胎牛血清FBS, 胶原酶，透明质酸酶，DMEM，胰酶，Trizol reagent试剂盒(Gibco公司)；RT 试剂盒、Taq DNA聚合酶(MBI公司)；TGFβ3(R&D公司)；STRO1，CD34，CD45，OCT4，CD105，Nestin分别购自于BioLegend和Serotec公司；丁羟基茴香醚，丝裂霉素(武汉凌飞公司)；其它生化试剂分别是国产和进口分析纯.0 a% i! p- ]/ f/ a- {* c3 ]
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1．2方法; b1 o8 ?, H5 {/ B8 Y' ]
+ }5 T. W* _1 Z2 I! T 1．2．1大鼠骨髓细胞的原代培养取1 mo龄SD大鼠（同济医学院动物实验中心提供），在无菌的条件下取出股骨和肱骨，用完全培养基（200 mL/L FBS，DMEM低糖，VitC 50 mg/L，青霉素10万U/L，链霉素100 mg/L, 两性霉素R 0.25 mg/L）分别冲洗骨髓腔，获得的细胞悬液充分打匀，然后用细胞筛网（Cell Strainers）过滤，制成单细胞悬液，将该细胞悬液调整细胞密度为1106/L后接种到培养板中. 相差显微镜下观察细胞生长情况，挑选单个细胞贴壁生长的区域，用笔做好标记.: C5 s7 d7 L% m4 F+ a7 B0 j; P$ Q' Y
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1．2．2小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的获取和培养在无菌条件下获取和分离胚龄为1 wk的小鼠胚胎，剪去头、四肢和内脏，超净台中将胚胎组织剪成肉泥状，碎块大约为1 cm3. 转移到离心管中，加入2.5 g/L的胰酶5 mL，37℃消化10 min. 取消化后的上清液，转入10 mL的离心管中，加入3 mL的完全培养基（FBS 100 mL/L，DMEM低糖，Vit C 50 mg/L，青霉素10万U/L，链霉素100 mg/L 两性霉素R 0.25 mg/L）. 余下的组织块按照上述的方法同样处理. 消化过程进行4～5次. 所获得的上清液一起转到一个50 mL的离心管中，1000 r/min离心8 min，弃上清，将细胞重新悬浮于30 mL的完全培养基中，用细胞筛网过滤，制成单细胞悬液，调整细胞浓度到2104，接种于培养瓶中. 通过不断的培养传代获得足够的MEF后，再用10 mg/L的丝裂霉素进行处理获得mtMEFs（mitomycin treated mouse embryonic fibroblasts），备用." |$ R# ~: t" a0 B- }/ W( Y. v8 D# D
* R# M3 A8 `/ S/ j5 ? 1．2．3单克隆细胞的挑出、扩增和鉴定将mtMEFs接种到六孔板中. 24 h后换液，除去未贴壁的细胞，备用. 原代培养的骨髓细胞生长到8 d时，出现单克隆样生长，在显微镜下通过无菌的方式将克隆样生长的细胞挑出. 首先在单个细胞贴壁生长的区域确定较为独立的具有MSCs生长形态的单细胞克隆，在相差显微镜下用笔在瓶壁上做好标记，然后在显微镜下用消毒后蘸有2.5 g/L胰酶的小片滤纸将单克隆生长的细胞从局部消化下来，分别接种到载有饲养层细胞mtMEFs的六孔板中（mtMEFs的接种密度为1106/L），继续培养. 当细胞达到80%融合后消化传代，转入培养瓶中进行培养，传至第4代后，将MSCs和新加入的mtMEFs按1∶1混合后再继续培养(因为mtMEF没有增殖能力，mtMEFs传到第4代时细胞会损失殆尽，所以需要补充新的细胞) 如此循环，在培养的过程中不断补充mtMEFs，直到单克隆培养的MSCs总共传代数为20代（20 passage，P20），取P20 MSCs进行细胞表面标志（STRO1，CD34，CD45，OCT4，CD105，Nestin）的流式鉴定.
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1．2．4MSCs和mtMEFs的混合培养和增殖能力的测定取1103的P20 MSCs和1103的mtMEFs按1∶1比例混合后，接种到96孔板中；同时取常规培养的P3代MSCs，分离和培养方法参考文献［3］，消化后取1103接种到96孔板中；将单纯mtMEFs消化后取1103个细胞接种到96孔板中，作为空白对照（不加MSCs）. 通过MTT 检测这3组细胞的增值率，每组每次检测10个样本，统计学分析结果后绘制生长曲线（统计软件Microcal Origin）.( H( J6 n2 G/ f, l
2 |' ~" }* m# j$ `! Y1 ?) m 1．2．5单克隆细胞来源的P20 MSCs成软骨能力的研究将P20 MSCs消化，取1105个细胞加入15 mL无菌离心管，1000 r/min的速度离心10 min，待细胞沉淀形成细胞团块后，换用诱导培养基（DMEM高糖，10 μg/L TGFβ3，110-7 mol/L地塞米松，50 mg/L Vit C，40 mg/L脯胺酸，100 mg/L的丙酮酸盐，50 g/L ITSPremix，分别于7，14，21，28 d取出培养的细胞团块， 3 g/L胶原酶，1 g/L的透明质酸酶和2.5 g/L胰酶在37℃消化3 h后，提取总RNA，用RTPCR测定胶原2（COLⅡ）, COLⅩ和Aggrecan（Agc）的表达,引物： COLⅡ上游 5′GGCGAGTCTTGCGTCTACC3′，下游 5′AGGCGTGAGGTCTTCTGTGA3′ (421 bp)； COLⅩ 上游 5′CTAAAGGAGTGCCTGGAC3′， 下游 5′TCTTGGGTCATAGTGCTG3′ (479 bp)； βactin 上游 5′GTAAAGACCTCTATGCCAACA3′， 下游 5′TAGAAGCATTTGCGGTGC3′ (259 bp)；Agc 上游 5′GAATCCGAGACACCAACG3′，下游 5′TCCTCTTCACCACCCACT3′（406 bp）；同时，14，28 d时将培养的细胞团块取出，固定6 h后，石蜡包埋，甲苯胺蓝染色测定软骨基质中的蛋白聚糖（proteoglycan）的表达.
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1．2．6单克隆细胞来源的P20 MSCs向神经样细胞分化能力的研究取P20 MSCs 1104个细胞接种于培养板中，24 h贴壁后换用诱导培养基，首先用预诱导培养基（DMEM高糖，200 mL/L FBS， 1 mmol/mL β巯基乙醇）培养24 h，然后用诱导培养基［DMEM高糖，20 g/L二甲基亚砜(DMSO)，200 mmoL/L丁羟基茴香醚 (BHA)］继续培养,之后每3 d换液. 1，3，6 d分别在相差显微镜下观察细胞的生长形态. 第6日固定细胞，免疫荧光方法鉴定细胞分化后表达的NSE.
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2结果
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3 E1 q; @& ]) s$ e 原代培养的骨髓细胞第3日开始出现细胞增殖，第7日单细胞开始出现孤立克隆样生长（图1），克隆周围的细胞呈旋涡状排列.挑出的单细胞克隆细胞从第5日后开始出现明显细胞克隆样增殖. 第8日细胞大量增殖并沿饲养层细胞的表面向周围延伸，在饲养层细胞间隙迅速贴壁生长（图2）.
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8 W: b' L7 R5 X( w2 c4 c) V. [ 单克隆培养P20 MSCs的表面标记的鉴定结果见图3：STRO1 , OCT4-, CD-34-, CD45-和CD105 , Nestin-的细胞分别占总的细胞的96.56%，99.03%，99.96%. 而OCT4 , STRO1-，CD34 , CD45 和CD105-, Nestin 的细胞仅占0.02%，0.04%和0.00%. 因此通过这种单克隆培养方式能获得大量高纯度的未分化的MSCs，同时因为培养的细胞是单克隆来源，均质的，所以应不含胚胎、造血和神经干细胞.
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三组细胞进行MTT测定， 获得的数据绘制生长曲线（图4），通过统计学分析，在饲养层细胞mtMEFs存在的情况下，单克隆来源的P20 MSCs的增殖率从第3日开始就要明显高于原代培养的P3 MSCs(P20 MSCs的增殖率=（P20 MSCs和mtMEFs混合培养的A值-mtMEFs的A值）/mtMEFs的A值， P3 MSCs的增殖率=P3 MSCs的A值/mtMEFs的A值)，结果有统计学差异（P
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. y* ~6 \; r& }: }; q. W- v 单克隆来源的P20 MSCs在向软骨的诱导分化过程中，第7，14，21，28日胶原的表达的情况（图5），可见在诱导的过程中COLⅡ,Ⅹ和Aggrecan表达的量不断增加，14和28 d时细胞外基质的蛋白聚糖通过甲苯胺蓝的染色，含量亦明显增加（图6）.! ~# `& b0 f; \* C! L
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单克隆来源的P20 MSCs在向神经样细胞的诱导分化过程中，细胞的形态逐渐变成多角形，有轴突的现象生成，经过NSE染色，在荧光显微镜下，可见诱导分化后的细胞出现相应的荧光染色（图7）., w7 D7 x5 N8 X6 |
9 v* B+ R2 w. E( Z V 3讨论
: p0 Y% l" X0 G. W T2 ~/ g7 d
- @) K# \* ], }0 c$ E7 V6 t 研究表明，MSCs是最具研究潜力的一种组织工程的种子细胞［4-5］. 但在MSCs的研究中还存在着许多问题，其中一个关键的问题就是在绝大部分实验中，我们获取的MSCs都是一种混合的细胞群，还缺乏明确获得完全均质和单一的MSCs的方法，而这个问题直接导致我们无法更精确的研究MSCs的生物学性状［6］，比如MSCs更精确的表面标记和可能的亚型，另外在MSCs的“横向分化能力上”，同样是因为现有实验中培养的MSCs是一群细胞的混合体，所以除向中胚层分化的在学术界得到肯定外，向其他胚层细胞的分化，即“横向分化能力”仍然缺乏直接的证据. 部分学者认为这些横向分化的能力来源于骨髓中其它的成体干细胞或胚胎干细胞或不同的成体干细胞相互融合所致［7］，而MSCs本身并不存在“横向分化能力”. 因此，本实验通过培养和扩增单克隆来源MSCs，获得理论上完全均质的MSCs,为解决上述问题提供了实验基础.8 s: J n1 ^0 g2 h
( a8 V( d T B 如何将获取的数量极少的单克隆来源的MSCs扩增成大量的可供实验的MSCs并保持MSCs的未分化特性和快速的增殖能力成了亟待解决的问题，我们选用在培养过程中使用较低密度的饲养层细胞mtMEFs，也曾经有学者使用过类似的方法培养成体干细胞［8］. mtMEFs能分泌有效促进MSCs增殖的FGF2和抑制MSCs分化的LIF［9］，而且经过丝裂霉素处理过的mtMEFs丧失了增殖能力，混合培养4～5代之后，mtMEFs就会完全消失而获得单一的单克隆来源的MSCs. 未单独使用FGF2和LIF代替饲养层细胞培养单克隆来源的MSCs的原因是：我们认为除了以上两种主要的细胞因子之外，挑取的单克隆细胞从少数几个细胞开始扩增成大量细胞时还需要周围细胞的支持形成一个有效的微环境［10］. 待挑取的单克隆细胞扩增到一定数目后，我们对其进行了表面标记的鉴定，结果符合MSCs. 在后续研究中，通过更细致的鉴定，还有可能鉴定出MSCs的亚类和其相应的生物学特征.9 }# v5 R9 e/ n/ p9 u" q
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( S3 l& p# }; i- C# s: q) ~2 Z; Z 在培养鉴定后，我们进行了细胞增殖和初步的分化实验. 发现在MSCs 和mtMEFs的混合培养过程中，单克隆来源P20 MSCs增殖速度要明显快于常规培养P3 MSCs，这为大量获得这种均质的MSCs提供了基础；在分化实验中，这种单克隆来源的MSCs不仅成功向软骨分化，还分化出了神经样细胞，因为这种MSCs是单克隆来源的，所以也为 MSCs的“横向分化能力”提供较为直接的证据. 在今后的研究中， 一方面我们需要进一步研究这些经过初步鉴定的单克隆来源MSCs可能有的更细致的差别， 另一方面， 全面的研究这种单克隆来源的MSCs向其他组织细胞分化的“横向分化能力”例如肝细胞， 胰岛样细胞等.
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2 y3 s+ o, F" I4 z基金项目：国家自然科学基金（30471753）
. F+ v, {( T- m; P7 L' g 【参考文献】9 r. d4 {* ^* b* u3 D9 _2 A
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发表于 2009-3-3 12:31
发表于 2015-6-4 10:54
