经角膜基质细胞诱导的大鼠骨髓间充质干细胞在人羊膜上构建角膜上皮移植片 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:31 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：戢维颖作者单位：（710032）中国陕西省西安市，第四军医大学西京医院眼科  全军眼科研究所
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      【摘要】  研究将骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）诱导分化后在羊膜表面培养构建角膜上皮移植片的可行性。方法：取SD大鼠骨髓间充质干细胞和角膜基质细胞，分别培养并传2代后进行共培养，取共培养7d后的MSC覆载于新鲜人羊膜，再培养7d。对MSC及诱导后MSC进行免疫荧光染色和扫描电镜检查；对覆载细胞的羊膜进行HE染色及免疫荧光染色。结果：MSC在体外培养条件下贴壁生长，免疫荧光染色CD29和CD44阳性，CK12阴性。经角膜基质细胞诱导分化后，MSC细胞CK12染色转为阳性。诱导后MSC接种到羊膜表面，迅速贴壁生长，组织学特性无明显改变，CK12染色仍为阳性。结论：经角膜基质细胞诱导的MSC表现出角膜上皮细胞特征，在羊膜上生长后保持不变。 3 z5 E0 T% b5 _* q: n
      【关键词】骨髓间充质干细胞皮细胞羊膜角膜上皮移植片
   　0引言8 [1 j. n, [; X
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眼表由角膜上皮、结膜上皮和泪膜3部分组成，眼表的稳定对维持角膜的透明性具有非常重要的作用。其中，角膜上皮再生的来源是角膜缘干细胞，而由于外伤、炎症、变性等疾病造成的眼表损伤，会导致角膜缘干细胞的大量缺失，从而引起角膜新生血管长入，角膜瘢痕形成。目前临床针对这类眼表疾病多采取单纯羊膜移植、羊膜联合角膜缘干细胞移植、板层角膜移植联合角膜缘干细胞移植、角膜缘干细胞移植联合穿透性角膜移植这几类手术方法，但以自体或同种异体角膜缘移植，因供体来源不足及异体移植引起的排斥反应而受限；而单纯羊膜移植重建眼表，因无上皮再生来源的干细胞而不能治疗角膜缘严重受损的眼表损伤。因此，构建一个完整的角膜上皮移植片成为解决这一问题的关键。组织工程技术的发展给治疗这一类疾病带来了希望，近期研究表明骨髓间充质干细胞具有分化为上皮细胞的潜能。我们探讨MSC作为种子细胞，经角膜基质细胞诱导分化为角膜上皮细胞后，种植于羊膜表面，与羊膜共同构建角膜上皮移植片的可行性。

　　1材料和方法
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　　1.1材料
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　　清洁级SD大鼠。低糖DMEM培养基及胎牛血清（Gibco），细胞培养基（DMEM，10mL/L胎牛血清）；角蛋白多克隆抗体cytokeratin13（鼠抗人）、cytokeratin12（兔抗鼠）及山羊抗兔FITC标记荧光二抗购于美国Gibco公司，罗丹明标记荧光二抗购于Santa公司。Transwell小室（美国Millipore公司）。# l7 Q6 p0 K8 D% x, ?/ ~
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　　1.2方法
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　　按文献[1]方法并加以改进来分离和培养大鼠间充质干细胞。取2wk龄SD大鼠，雌雄不限，断颈处死后在750mL/L乙醇中浸泡10min，无菌条件下，分离皮肤及肌肉，暴露骨髓腔，用DMEM液反复冲洗骨髓腔，将冲出的液体收集于培养皿，过筛、离心后制成单细胞悬液，按1107/L密度接种于75mL培养瓶，加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基，24h换液去除未贴壁细胞，以后每2～3d换液，换液前PBS洗去部分未贴壁细胞，每日倒置相差显微镜观察细胞形态及生长状况，当70%～80％细胞达到融合时用2.5g/L胰蛋白酶消化传代，进行扩增培养。取生长为2代的MSC接种于预置在24孔板内的无菌盖玻片上，当细胞生长2～3d基本融合时，取出，用40g/L多聚甲醛固定30 min，制成细胞爬片，行CD44，CD45，CD29直接免疫细胞荧光化学染色，同时用PBS代替一抗作为空白对照[1]。取1wk龄SD大鼠，雌雄不限，断颈处死后在750mL/L乙醇中浸泡10min，于无菌条件下取大鼠眼球，显微镜下剪取角膜中央区域，将角膜剪碎成约为1mm1mm的小块后放入离心管，加入胶原酶1mL，放入温箱消化1h，过筛、离心后加入培养基，制成细胞悬液，按1106/L密度接种于培养瓶中，48h换液，以后每2 ～3d换液，每日倒置相差显微镜观察细胞形态及生长状况，待细胞生长70%～80%基本融合时用2.5g/L胰蛋白酶消化传代。4 Y4 K  |* w2 N

　　1.2.1 MSC的诱导分化4 c) N5 e& i/ J" x  }

　　取第2代的MSC与第2代的角膜基质细胞放置于Transwell体系中共培养，培养时6孔板下层接种MSC（5105/L），上层接种角膜基质细胞（1105/L），共培养体系上、下层细胞被隔开，培养液和可溶性因子可以自由通过。每日半量换液，置于50mL/L CO2,37°C培养箱中共培养7d，每日倒置像差显微镜观察细胞生长状况。将共培养7d的MSC用2.5g/L胰蛋白酶消化后，接种于预置在24孔板内的无菌盖玻片上，当细胞生长基本融合时，取出进行免疫细胞荧光染色：40g/L多聚甲醛固定，PBS溶液振洗3次，封闭血清封闭；每张爬片加入一抗（CK12）50μL，37°C孵育2h；PBS冲洗后每张爬片加入50μL山羊抗兔FITC标记荧光二抗，37°C避光孵育1h；PBS冲洗后用缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。对照组为PBS溶液代替一抗。另细胞爬片用20g/L戊二醛固定，扫描电镜观察。
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　　1.2.2诱导后MSC接种于羊膜上培养& X/ ?; v+ h3 }  t7 D! b2 s
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　　先在无菌条件下取健康足月剖腹产产妇的羊膜，用含1106U/L庆大霉素的无菌生理盐水洗去血迹，浸泡40min，在无菌条件下操作，去除滋养层，将羊膜修剪成大小约为3cm3cm的组织块，分装于培养皿后冻存于－80°C冰箱保存备用。用前常温解冻，水化后PBS冲洗，2.5g/L胰蛋白酶37°C培养箱消化1h，去除海绵层及纤维母细胞层，PBS反复冲洗后，将上皮面朝上铺于不锈钢支架上备用。消化的羊膜经HE染色，为纤维结构，无细胞残留。将共培养7d Transwell体系中的MSC消化后，以1106/L密度接种于上皮面向上的羊膜表面，置50mL/L CO2,37°C培养箱贴壁4h后加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基，以后每2d换液，共培养7d，形成上皮细胞片。每日倒置相差显微镜观察细胞生长情况。将未诱导MSC覆载于羊膜作为诱导的阴性对照。另取覆载MSC培养7d的羊膜（上皮细胞片），用40g/L多聚甲醛固定，同上文进行角膜上皮样细胞免疫荧光鉴定，对照组为PBS代替一抗；另取部分羊膜做切片和HE染色。2 o2 F) o7 J9 A& f; w' C/ ^7 u' v
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　　2结果
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　　2.1 MSC的培养和鉴定

　　原代MSC 24h后贴壁，完全伸展，呈梭形、多角形，形态不规则，小部分呈圆形的造血细胞经PBS冲洗后弃除。培养7d细胞基本融合后传代，经2次传代，P2代细胞形态为成纤维细胞样，胞体呈长梭形，核为椭圆形，形态一致，倒置显微镜下观察呈漩涡状、辐射状排列（图1A），细胞生长迅速，4～5d传代。取P2代细胞行细胞表面标志荧光染色，结果显示CD29，CD44呈阳性[1]（图1B），CD34，CD45阴性，角蛋白CK12染色阴性。扫描电镜下，显示细胞呈长梭形的纤维细胞样，细胞突丰富（图1C），以上符合骨髓MSC特征。

　　2.2 MSC的诱导分化
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　　MSC与角膜基质细胞共培养7d后，诱导后的MSC在倒置显微镜下观察，可见细胞形态多呈四角形，扁平，形态变大，长梭形细胞减少（图2A）；免疫荧光染色检查示细胞表面角蛋白CK12染色呈阳性（图2B）；扫描电镜检查，见大量上皮样细胞存在，细胞连成片状，细胞间紧密连接结构清晰，形态学分析此紧密连接为上皮细胞的特征性结构，提示MSC已转化为上皮细胞（图2C）；证实诱导后的MSC已定向分化为角膜上皮细胞。; L, q; j; y. u3 {3 i, N) J

　　2.3上皮细胞片的观察与鉴定

　　诱导后的MSC按1106/L的密度接种于羊膜，4 h开始贴壁，24 ～48h细胞完全伸展，倒置像差显微镜下观察细胞生长迅速、折光度强、细胞活力好，3d已单层融合，细胞形态清楚，与接种前未发生明显形态学改变（图3A，B）， 5～7d开始形成复层上皮样结构，细胞结构仍清晰，10d细胞生长过于密集，结构不清，老化细胞增多，以7 d的细胞密度较为合适。HE染色结果可见羊膜胶原纤维上有上皮细胞生长，组织结构紧凑，HE颜色对比清晰，细胞与羊膜间连接紧密（图3C）。行CK12免疫荧光染色细胞呈阳性反应（图3D）。
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　　3讨论: |  \& A8 Q" W$ H

眼表的稳定性对维持角膜的透明性具有非常重要的作用，当眼表发生损伤时，易引起角膜上皮结膜化、角膜新生血管、角膜上皮缺损、持续性角膜溃疡、角膜瘢痕形成等一系列改变。轻度的眼表损伤行角膜缘干细胞移植等方法，可获得一定疗效，但当发生双眼严重的眼表损伤时，由于缺乏健康的角膜缘干细胞和角膜供体来源，目前尚无有效的治疗方法。我们的目的是为组织工程角膜寻找一种更好的途径，将骨髓间充质干细胞作为种子细胞，和羊膜一起构建一个完整健康的角膜上皮移植片，为自体移植打下基础。骨髓间充质干细胞是一种存在于骨髓中具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体，在体外不同诱导条件下可转化为多种不同类型的细胞[2,3]，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等中、内、外胚层细胞[46]，易于获得，可于体外进行扩增培养的特点，使MSC成为新的种子细胞，国外研究发现MSC同时具有编码内皮和上皮组织的基因[7]。同时国内近期研究报道显示，MSC可在体外诱导分化为上皮细胞，体内实验研究表明MSC在体内的微环境下具有分化为上皮细胞的潜能[8]，且我们的前期研究已经也表明MSC有分化为上皮样细胞的潜能[1]。角膜基质是角膜上皮细胞和角膜缘干细胞的微环境，有维持角膜上皮细胞特性的作用，含有多种自分泌和旁分泌细胞因子及其受体，共同组成了角膜缘基质层复杂的细胞因子调控环境，维持角膜缘干细胞的正常分化，所以本实验利用自体角膜基质细胞给MSC提供生长的微环境，观察MSC诱导后分化为角膜上皮样细胞的情况：扫描电镜显示诱导后的MSC呈上皮样细胞结构存在，细胞连成片状，连接紧密；细胞表面角蛋白CK12呈阳性，证明已转化为角膜上皮细胞，具有上皮细胞的特征。

　　我们采用羊膜为细胞生长平台，因为羊膜是半透明组织，可提供连续的基底膜，含有与角膜基质相同的板层体，及VII型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和各种整合蛋白[9]。层粘连蛋白有利于细胞的贴附，给细胞提供了良好的体外生长微环境。近年来，Tsai等[10]将健眼角膜缘上皮组织种植于羊膜上，体外培养2～3wk后植回患眼，随访15mo，6例中有5例视力得到明显提高。Koizumi等[1113]证实用去除上皮细胞的羊膜以及3T3细胞做饲养细胞培养角膜缘干细胞，移植术后可以获得更好的效果。但近年来的研究多为异体移植，对移植片的排斥也成为治疗效果一大难题。我们显示：将诱导后的MSC接种于羊膜（在羊膜制备过程中，去除上皮层、纤维母细胞层和海绵层，以利于细胞更好的贴附）后，细胞很快贴壁，经组织学和免疫细胞化学检查，细胞形态及其表面标志均未发生改变，CK12仍呈阳性。我们结果提示羊膜可作为诱导后MSC的细胞覆载体，作为细胞生长平台，不改变细胞本身的形态及性质，对其分化不产生影响，便于在手术中直接应用覆盖固定在受损伤的角膜上，为下一步活体动物眼表重建提供了材料。
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　　综上所述，培养角膜上皮细胞进行自体移植是治疗眼表疾病的理想方法，既避免了异体移植免疫排斥等问题，又避免了健眼取材细胞量少、对健眼造成损伤的问题。我们利用组织工程技术外体培养自体MSC，诱导分化为角膜上皮细胞，取材方便，细胞量大，与羊膜一起构建自体的角膜上皮移植片，也便于应用，经进一步的动物实验验证后，可能为治疗角膜缘干细胞缺乏、眼表严重损伤的角膜疾病提供了新的治疗途径。
      【参考文献】& W+ i* {3 G  @' I" ?
　　1姜廷帅,蔡莉，惠延年,等.大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞.国际眼科杂志 2007;7(2):339341

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　　3邵毅,裴重刚.干细胞治疗视网膜疾病的研究进展.国际眼科杂志 2006;6(2);441445

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　　6 Krause DS, Theise ND, Collector MI, et al. MutiOrgan, mutiLineage engraftment by a single bone marrow derived stem cell. Cell 2001;105(3):369377
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　　7 Tremain N, Korkko J, Ibberson D, et al. MicroSAGE analysis of 2353 expressed genes in a single cellderived colony of undifferentiated human mesenchymal stem cells reveal mRNAs of multiple cell lineages. Stem Cells2001;19(5):408418) {8 p: R# O! t2 m% x4 ?8 p
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　　8黄丹平，葛坚，高楠，等.诱导骨髓间充质干细胞分化为角膜上皮样细胞的初步研究.中国病理生理杂志 2007;23(5):9991003# u9 X& \* S) D
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: [1 l& \( D/ j
　　9 Fukuda K, Chikama T, Nakamura M, et al. Differential distribution of subchains of the basement membrane components type IV collagen and laminin among the amniotic membrane, cornea and conjunctiva. Cornea 1999;18(1):7379

　　10 Tsai RJ, Li LM, Chen JK. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelia cells. N Engl J Med 2000;343(2):1361388 f5 D* V0 u+ ?
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4 U+ E2 M8 p: ?4 I
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　　11 Koizumi N, Inatomi T, Quantock AJ, et al. Amniotic membrane as a substrate for cultivating limbal corneal epithelial cells for autologous transplantation in rabbits. Cornea2000;19(1):6571& x: `! ~& V2 n3 j/ a# q) _

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