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作者：冯铭 王任直作者单位：中国医学科学院-中国协和医科大学北京协和医院神经外科， 北京 100730 1 i, v- R; j0 `4 i# z0 r
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$ q `) U) o6 I3 T 【摘要】 近年来，干细胞在神经系统疾病、血液病和心脏疾病治疗中获得广泛应用。干细胞移植后，活体示踪干细胞的存活和迁徙具有重要意义。分子影像学技术的发展使干细胞活体示踪成为可能，光学成像、磁共振成像、单光子发射计算机断层显像、正电子发射计算机断层显像是临床和实验中常用的分子影像学方法，具有各自的优势和缺点。本文即对以上成像方法在干细胞活体示踪方面的研究进展及应用前景予以综述。 0 ^. l" a8 Q+ ~, y2 |
【关键词】分子影像学 干细胞移植 荧光抗体技术
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( |: w5 G2 K2 W: T" T5 j 干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的细胞，对脑血管病、神经退行性病、血液病、缺血性心肌病等有着广阔的应用前景。分子影像学的发展使在活体状态下示踪移植细胞的存活、迁徙成为现实。 $ C( y8 L, P0 P
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Weissleder[1]于1999年提出分子影像学概念，即在细胞和分子水平活体评价生物过程，包括体内示踪细胞的存活、迁徙。目前，分子影像学用于干细胞活体示踪的技术主要包括光学成像、磁共振成像、核医学成像，后者主要包括单光子发射计算机断层显像 （single photon emission computed tomography，SPECT） 和正电子发射计算机断层显像 （positron emission tomography，PET）。$ t+ k; o$ r. \+ W4 s
5 n& P% {: @$ H2 \0 ~( \. N# ~ 1光学成像/ i; a9 U) F! b
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. j6 i9 e! q" M1 E 检测活体动物体内基因表达及细胞活动的光学成像技术具有操作简便、直观性强的优点，其关键是设计生物相容性好的近红外荧光染料，研制特异性影像探针，合成可激发的生物发光蛋白[2]。光学成像包括生物发光成像和荧光成像，前者利用动物体内的自发荧光，不需要激发光源；后者需要外界激发光源。
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1.1生物发光成像生物发光技术采用荧光素酶基因标记干细胞或DNA， 靠酶和底物的特异作用而发光。由于动物体自身不会发光，故生物发光背景极低，从动物体表的信号水平可直接得出发光细胞的数量。Maxwell等[3]用荧光基团结合的氧化铁纳米颗粒标记造血干细胞，进行荧光成像；与流式细胞计数结合，可以评价干细胞标记效率和归巢能力。Rosen等[4]采用纳米荧光探针标记间充质干细胞，植入哺乳动物心脏，结果8周后仍可看到移植细胞。* a$ w( G1 K$ v6 X, ~0 ]
6 S5 e) _# c0 B3 a4 p 1.2荧光成像荧光技术采用荧光报告基因，如绿色荧光蛋白 （GFP） 等荧光染料对干细胞进行标记，报告基因、荧光染料受到激发即可产生荧光。荧光成像的波长范围为400～900 nm，常见荧光材料具有不同的波长范围可供选择[5]。这种技术较生物发光操作简单，无需注入底物，发光强度高。但生物体内许多物质在受到激发光激发后，会产生较强的自发荧光，以至会严重影响检测的灵敏度，特别是当发光细胞位于组织内部时，背景底色会很高。该技术的主要优点是无辐射，可进行连续、实时监测，灵敏度、分辨率较高，而花费相对较低。光的穿透能力很有限，仅为数毫米到数厘米，因此，荧光成像多用于小动物的实验研究。另外，由于散射等原因，其空间定位能力较差。0 c2 l3 t' ^! | U: O) W7 x, x
7 {9 I; ]+ S; L8 u6 v 2磁共振成像
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MRI是最常用的成像方法，由于有效成像时间长，可观察细胞的动态迁徙过程，空间、时间分辨率高，对比度好，因此，其前景看好。
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MRI主要依赖纵向 （T1）、横向 （T2） 弛豫时间及使用对比剂前后弛豫时间的差别来诊断。常用的对比剂有两种：一种是钆类 （Gd3 ），T1WI为高信号，也称阳性对比剂；另一种为超顺磁性对比剂，如SPIO （superpara-maganetic iron oxide） 和USPIO （ultra- small superparamagnetic iron oxide），T2WI和T2*WI （对铁颗粒敏感） 为明显的低信号，称阴性对比剂。Gd3 标记的细胞只能在移植后1周内检测到，不能用来长期监测细胞的存活及迁徙[6]。而SPIO在体内更稳定，也能提供更好的对比度；居胜红等[7]采用国产的磁性纳米粒子标记人脐血间充质干细胞，获得了满意的结果。单纯应用SPIO标记干细胞效率较低， 而通过转染剂可显著提高标记效率。常用转染剂包括鱼精蛋白 （PRO）、多聚赖氨酸 （PLL）、繁枝体大分子化合物 （Dendrimer） 等；其中以阳离子转染剂PLL应用最多，其通过电荷吸附作用结合SPIO，可以有效地被内涵体吞噬。菲立磁 （Feridex-PLL） 对间充质干细胞的活力和增殖能力无影响[8]，但可抑制干细胞向软骨方向分化[9]，而向脂肪和骨方向的分化不受影响。) T5 p& o- G) | K: Z
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) D! m4 W$ T2 |) O, H5 m- ?( t1 I 目前，磁共振可以检测到很少量的细胞甚至单细胞[10]。Hoehn等[11]采用USPIO标记大鼠胚胎干细胞，植入大鼠脑缺血对侧的皮质下及纹状体，数天后，MRI显示出移植细胞向缺血区域移行的路径。魏俊吉等[12]将标记Feridex的人骨髓基质干细胞 （hBMSC） 植入脑缺血大鼠的同侧及对侧脑实质内，MRI显示移植后第14天，缺血同侧移植组hBMSC向缺血灶边缘迁移，缺血对侧hBMSC沿胼胝体弥散。Ju等[13]采用SPIO标记鼠BMSC，植入鼠肝损害模型，MRI可活体观察到移植细胞，组织学检查证实肝脏内有存活的BMSC。
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+ a o- x, k% |/ g1 ~! t7 r 用SPIO标记干细胞具有许多优势：信号对比度好，尤其在T2WI和T2*WI；对比剂由可生物降解的铁组成，分解后参与铁代谢，可被机体再利用；核心层外包被葡聚糖，可直接结合各种功能性基团；很容易用光镜或电镜观察到；通过改变颗粒的大小，可以调整其磁效应。但SPIO的应用也有一些限制：铁颗粒会引起信号的丢失，产生所谓的黑洞效应，直接影响MRI相关解剖结构的显示，不能区分移植细胞和人工植入物造成的磁敏感性伪影；细胞所携带的非遗传物质会逐渐减少，被排出细胞外并被其他细胞摄取。目前的研究结果表明：至少在移植后18周内，可以通过MRI检测到标记的细胞[14]。
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3核医学显像
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SPECT和PET为核素示踪的显像技术。PET的显像原理决定了它较SPECT具有更高的空间分辨率和敏感性，其在神经系统中应用最广泛[15]。SPECT扫描需要准直器，只能检测到身体发射的小部分γ-射线，影响其敏感性；另外，散射也降低了它的空间分辨率[16]。+ g0 g% J5 D0 ~$ k# y
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各种组织或细胞均有特异或相对特异的分子标志物，利用适当的放射性核素标记这些特异性标志物来作为探针，能够在活体显示组织、细胞的存在和状态。根据感兴趣分子与探针的不同，核医学显像可以分为代谢显像、抗体显像、受体显像、报告基因显像和反义显像。2 e5 d/ V8 }5 F0 M1 v3 N
) F/ J- F3 b, d; Y8 n- M/ U 3.1代谢显像其在临床科研中应用较多。最常用的分子探针是组织和细胞的代谢底物或类似物。如氟-18-脱氧葡萄糖 （18F-FDG） 是葡萄糖的类似物，被细胞摄取后在己糖激酶的作用下完成磷酸化，然后停留在细胞内浓聚而不再参于代谢。18F-FDG扫描可反映葡萄糖的代谢情况，从而间接反映疾病的状况[17]。Hofmann等[18]研究18F-FDG标记的BMSC在心肌梗死病人心肌中的归巢情况，结果在心肌梗死区域 （主要是心肌梗死边缘） 发现了移植细胞。由于葡萄糖和氨基酸代谢是多通路、多分子调节的，故利用代谢显像示踪干细胞增殖的特异性较低。Doyle等[17]利用18F-FDG 标记前体细胞，通过冠状动脉移植治疗心肌梗死，利用PET或CT可动态观察到细胞存活情况。Stelljes等[19]利用18F-FDG-PET做为一种敏感、无创的检查方法来检测移植物抗宿主病 （GVHD）。
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3.2抗体显像抗体显像是利用抗原、抗体的特异结合，将抗体作为探针，以检测细胞表面抗原的存在。这一技术的关键是获得同源性抗体，并构造分子量小、呈脂溶性的抗体。
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6 q1 K" o/ {4 K* U8 s 3.3受体显像受体显像是将放射性标记配基引入体内，与特异性受体结合，从而显示受体作用的部位。受体显像最有可能首先进入干细胞活体示踪领域。神经受体显像剂有相对成熟的药物或药物衍生物作为标记底物。国内研究者用11C-raclopride与D2受体结合，进行PET显像，在神经前体细胞的移植部位看到了明显的放射性浓聚[20]。+ R G9 b k) ]. M: B- r! ]
9 o8 i+ x$ O6 R" k3 _ 3.4报告基因显像报告基因显像将报告基因 （如GFP） 与靶基因耦联，通过测定表型蛋白，间接反映靶基因的表达。一种报告基因可以与多种靶基因耦联，一个报告基因系统能用于多种基因显像。但必须在体外将报告基因与靶基因耦联，然后用载体导入动物或人体内。
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3.5反义显像反义显像通过螯合剂将核素与反义寡核苷酸连接，在细胞内与靶基因的mRNA互补结合，从而显像，可反映目标DNA的转录情况。虽然这种技术尚未成熟，但其可能是彻底解决干细胞活体示踪技术的最终途径。! w3 E6 {6 M( U" `
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利用PET示踪干细胞，在灵敏度、定量分析方面具有较大的优势，并已在干细胞移植治疗帕金森病研究中获得了很好的效果。但是，目前核医学显像仍不能完全解决干细胞活体示踪的问题，其主要原因是缺乏特异性干细胞标记物。随着干细胞特异性标记物的发现及分子探针技术的发展，PET将成为最有前途的示踪干细胞的分子影像学技术。
4 P1 z: A. A& a- M2 o' b 【参考文献】: P4 t/ M3 d( w% n) `- f
[1] WEISSLEDER R. Molecular imaging: exploring the next frontier [J]. Radiology, 1999, 212(3): 609-614.: i) ^9 d8 q3 e
/ t2 X1 E3 r& r P% @6 U1 j$ B. ?
! S& u# c' p W3 Q7 a$ G9 [8 u4 I! x
9 m5 |* ^: n1 L9 L3 g( j4 F* c# w [2] SHAH K, WEISSLEDER R. Molecular optical imaging: applications leading to the development of present day therapeutics [J]. NeuroRx, 2005, 2(2): 215-225.
/ `) z& G; M& b. D0 Y. U# L2 b$ R0 b2 k) r" h
$ o! s5 M$ F* l! H2 G
% p# V8 d3 Z; R5 F3 H/ j [3] MAXWELL D J, BONDE J, HESS D A, et al. Fluorophore- conjugated iron oxide nanoparticle labeling and analysis of engrafting human hematopoietic stem cells [J]. Stem Cells, 2008, 26(2): 517-524.9 f& i- D7 D- c/ G+ u; I6 U+ ^
2 F9 U' H$ i, R- ]; Q
4 M: K. x: r) M/ V1 W( a7 \
; E9 K# I, G# r$ Q8 m7 y5 J
[4] ROSEN A B, KELLY D J, SCHULDT A J, et al. Finding fluorescent needles in the cardiac haystack: tracking human mesenchymal stem cells labeled with quantum dots for quantitative in vivo three-dimensional fluorescence analysis [J]. Stem Cells, 2007, 25(8): 2128-2138.
6 s) g0 ^/ ]2 `$ M7 V
4 ^9 V/ u9 g% T8 o/ L$ h* A/ N* h# l1 Q
/ G7 r( S& q1 I3 Q [5] VOURA E B, JAISWAL J K, MATTOUSSI H, et al. Tracking metastatic tumor cell extravasation with quantum dot nanocrystals and fluorescence emission-scanning micro- scopy [J]. Nat Med, 2004, 10(9): 993-998.
/ U# {% q0 N5 V8 L- C
9 K) l4 V# w" A. f1 ^) D
) _8 c7 W* f) o, J; n% K' J$ C h" R9 z9 _9 V+ @6 k9 f9 A) L7 p
[6] MODO M, CASH D, MELLODEW K, et al. Tracking trans- planted stem cell migration using bifunctional, contrast agent- enhanced, magnetic resonance imaging [J]. Neuroimage, 2002, 17(2): 803-811.9 z+ d# d5 {0 y$ \% O
* L* a; ~. {- h
[+ y5 P- g) j" @
( B9 z0 a5 r4 Z& s
[7] 居胜红, 滕皋军, 毛曦, 等. 脐血间充质干细胞磁探针标记和MR成像研究 [J]. 中华放射学杂志, 2005, 39(1): 101- 106.9 q3 L K( i, Z- H# X
& J& h; A4 R* n6 {; R; {
0 S" Q# Z3 N4 d. e4 Z- n1 Y$ B) F
[8] ARBAB A S, BASHAW L A, MILLER B R, et al. Cha- racterization of biophysical and metabolic properties of cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and transfection agent for cellular MR imaging [J]. Radiology, 2003, 229(3): 838-846.
0 ?: x. {; g8 |2 _/ ^+ x
0 U3 b! m! _9 f, k: Z
5 L: V2 g x, c3 g$ r2 ]. p. b: S& f
[9] KOSTURA L, KRAITCHMAN D L, MACKAY A M, et al. Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chon- drogenesis but not adipogenesis or osteogenesis [J]. NMR Biomed, 2004, 17(7): 513-517.
; M& h9 Y6 u( L& q V% g. i3 [; b0 g8 l: s
6 g: V3 c# t) W, b# s) @" q' Z
* X! Z* ~$ O/ _; N8 C/ c
[10] SHAPIRO E M, SHARER K, SKRTIC S, et al. In vivo detection of single cells by MRI [J]. Magn Reson Med, 2006, 55(2): 242-249.
$ ^! S* {% Q+ U: r, d
( g9 V) R9 W, I# \9 p0 P' J' N
& {0 D( M% x7 M5 {
[11] HOEHN M, KUSTERMANN E, BLUNK J, et al. Moni- toring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(25): 16267-16272.
4 Q' X: L. X" M
- _( h; x* f* S- ~3 Y7 P' T. n1 U8 ]3 }
! f" }6 |0 P7 C5 k- P1 V2 T
9 z9 X. [1 K+ m. Z6 J- p# `) n [12] 魏俊吉, 王任直, 陆菁菁, 等. 超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑卒中的磁共振活体追踪 [J]. 中国医学科学院学报, 2007, 29(1): 73-77.
$ S. Y% D2 E- Q, @ i0 t1 H+ g- W% R7 \3 {& N
& E" U( o& o. A" F/ i3 J; k5 X( G0 p0 l5 _% |
[13] JU S, TENG G J, LU H, et al. In vivo MR tracking of mesenchymal stem cells in rat liver after intrasplenic trans- plantation [J]. Radiology, 2007, 245(1): 206-215.2 P$ O$ q% c4 J
& t+ `' O& u' k. \' Q+ {2 J
: ?8 p( |: s4 p0 L4 {& L- d
. u5 i7 [) p# a: J3 M( h/ b [14] GUZMAN R, UCHIDA N, BLISS T M, et al. Long-term monitoring of transplanted human neural stem cells in de- velopmental and pathological contexts with MRI [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(24): 10211-10216.0 N& D9 ~; u# O0 g6 F& a
" C" k" z9 W4 k. G0 Z
" ]& @ t* i5 g: r
6 t) w! {1 r# J1 V# X4 |% P [15] KIRIK D, BREYSSE N, BJORKLUND T, et al. Imaging in cell-based therapy for neurodegenerative diseases [J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2005, 32 (Suppl 2): 417-434.
" Z8 | i3 R3 M0 ] Q: G& F' Y" Z' }
0 f2 t7 T+ }7 ?( ?6 I$ m, r5 X0 ]" b
[16] MILLER J C, TRALL J H. Clinical molecular imaging [J]. J Am Coll Radiol, 2004, 1(1 Suppl): 4-23.
) r( U& {) o( w( O( y( m8 }1 U0 W3 m0 p( H2 N
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发表于 2009-3-3 12:31
发表于 2010-3-23 15:04
