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作者：曹立新 王毅作者单位：哈尔滨医科大学第一临床医学院（曹立新）
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【摘要】 目的 观察用他克莫司（tacrolimus ，FK506）联合骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell，BMSCs）移植对脊髓损伤后再生的影响，进一步探讨两者对急性脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的作用和机制。方法 钳夹法制作SD（Spraque-Dawley）大鼠急性脊髓损伤动物模型30只，随机分成三组。A组为单纯损伤组，B组为单纯骨髓干细胞移植组，C组为骨髓干细胞联合FK506组。A、B、C三组一周后再次手术，暴露出原脊髓损伤处，A组将生理盐水10μl用微量注射器注入于脊髓损伤区域远近端；B、C两组将体外培养的骨髓间充质干细胞10μl用微量注射器分别注入于脊髓损伤远近端；C组同时另行腹腔再注射0.25%FK506一次，用量1mg/kg。期间加强动物的护理，于术前、术后1w、2w、4w、6w、8w采用BBB评分、斜板实验及后肢行为学评分观察神经恢复情况。8周后取材，行免疫组化检查及病理学检查。结果 各组BBB评分B、C两组大鼠后肢运动功能恢复较明显，B、C组注射细胞后2周开始出现后肢活动，逐步恢复排尿，伤后4周变化最为明显，可见明显后肢活动和尾巴的摆动，伤后8周，已可见协调运动，C组的恢复情况较B组为快，BBB最高评分可达14分，A组亦有所恢复，但程度较轻。B、C 两组评分高于A组，B、C两组统计学上有差异（P＜0.05）。C组与A组在6周以后的评分有显著性差异（P＜0.01）。斜板实验和后肢行为学评分与BBB评分类似。免疫组化显示：A组切片见伤处为瘢痕连接，结构紊乱，邻近有明显空洞形成，未见神经轴索通过。B、C组亦见瘢痕形成，但可见少量神经轴索样结构。A组伤处邻近神经元胞体NF200阳性细胞较少，邻近脊髓组织GFAP阳性细胞亦较少。B组伤处可见GFAP及NF阳性纤维，但排列较紊乱，无正常结构。C组较B组邻近脊髓神经元胞体NF200阳性细胞较多，GFAP阳性细胞亦较多。C组大鼠脊髓损伤边缘Nogo阳性神经元较A、B两组明显减少。结论 脊髓损伤的大鼠移植的大鼠骨髓间充质干细胞在脊髓损伤部位能长期存活，并能向邻近脊髓内迁徙，骨髓间充质干细胞移植对于后肢功能的恢复有促进作用；联合应用FK506有协同效果；脊髓损伤后功能恢复需要一个多种神经因子共同参与的复杂的微环境。
+ q# Z( p% l+ A3 S 【关键词】脊髓损伤 骨髓间充质干细胞 FK506 功能恢复- _, u6 i) D% A" k+ m% f$ g
急性脊髓损伤后的治疗是一个长久以来困扰医学界的难题，各种机制引起的神经细胞坏死和凋亡在脊髓损伤的发生和发展中起到了重要的作用。因此，任何减少神经元丧失的干预措施都有可能改善脊髓损伤的预后。研究发现，应用外源性神经营养因子（neurotrophic factors,NTFs）可以促进神经元修复、轴突再生。骨髓间充质干细胞是骨髓中的一种非造血类成体干细胞，易于获取和增殖，可诱导分化为神经元细胞和促进原神经细胞轴突再生，骨髓间充质干细胞移植是近年来研究的热点。另有研究证实，一种具有极强免疫抑制作用的大环内酯类药物——他克莫司可促进大鼠脊髓损伤后的功能恢复，为脊髓损伤的药物治疗开辟了新的可能途径。本实验以SD大鼠为研究对象，旨在观察大鼠急性脊髓损伤后早期联合应用BMSCs和腹腔注射他克莫司对损伤区神经元、轴突保护和修复作用。7 Y, }$ b1 @6 G/ c( ~
( N/ V& I9 ~0 I& T5 ^# G% u 1材料与方法
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1.1大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养、纯化和扩增取1月龄SD大鼠（雌雄不限），无菌条件下取出去骺端股骨和胫骨。用注射器吸1ml含血清的基础培养液，收集冲出来的骨髓。将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸，以打散组织成为细胞悬液。收集细胞悬液，离心。用干细胞培养液重悬沉淀的细胞。取少量细胞悬液与等量4%乙酸混合以溶解红细胞，然后计数有核细胞。用干细胞培养液调节细胞密度，进行原代接种，经多次传代扩增培养，使BMSCs逐渐得到纯化和扩增。MBSCs在体外培养融合达到80%后，换液、加入含BrdU的培养基进行标记。取第4～7代细胞融合达80%以上的BMSCs备用。
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1.20.25%FK506溶液的制备他克莫司（FK506）250mg，丙二醇400ml，注射用水600ml混匀。将上述混合液用微孔滤膜滤器过滤，测定pH值、含量，合格后罐装于包装瓶中，压盖,115℃灭菌30分钟。检测澄明度，合格即得。& g' D6 U6 f3 X/ j7 q0 T7 |
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1.3完全性脊髓损伤动物模型的制作选择健康雌性SD大鼠30只（购自中国医学科学院动物实验室），体重200～250g，实验室饲养2周后，用2.5％氯胺酮20mg/kg腹腔注射麻醉， 无菌条件下手术显露T8-T9棘突及椎板（以食指于双侧前肢水平连线向下约2.0cm处自上向下触摸棘突，仔细体会可感觉棘突突然向下有一落差感，此即为T9棘突），用特制大鼠椎板钳咬除T8部分棘突及T9棘突及椎板，显露硬膜。用纤维镊子钳夹T9段脊髓3～4秒，使成完全脊髓损伤，表现为大鼠双后肢突然猛烈蹬直，尾巴旋转一周为入选标准。以青霉素盐水冲洗伤口，检查无出血后，逐层缝合各层组织。
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1.4动物分组将急性脊髓损伤动物模型30只，随机分成三组，每组10只。A组为单纯损伤组对照组，B组为单纯干细胞移植治疗对照组，C为干细胞移植联合FK506治疗组。A、B、C三组一周后再次手术，暴露出原脊髓损伤处，A组将生理盐水10μl用微量注射器注入于脊髓损伤区域远近端；B、C两组将体外培养的骨髓间充质干细胞10μl用微量注射器分别注入于脊髓损伤远近端，3min内推完，之后留针5min并用医用生物胶封闭针孔以防止细胞悬液顺针道外溢，逐层缝合伤口； C组脊髓损伤区域注入骨髓间充质干细胞悬液10μl同时另行腹腔注射0.25%FK506一次，用量1mg/kg。各组动物术后按组置于普通鼠笼喂养，每天人工排尿两次。术后共有9只动物死亡，均按其原来分组予以补充。
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# ^3 r/ P1 f' q( D 1.5评估方法采用BBB（Basso Beattie and Bresnahan， BBB score）运动功能评分［1］，斜板实验和后肢行为学6级评分标准［2］来评估大鼠后肢运动功能的恢复情况。
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6 _0 H. C [( a1 _( x: O BBB功能评分：将动物放置于平台上，观察记录其后肢的行走及肢体活动。评分分三部分：第一部分为0～7分，评判动物后肢各关节活动；第二部分为8～13分，评判后肢的步态及协调功能；第三部分为14～21分，评判运动中爪的精细动作，三项满分为21分。实验动物分别在术前、术后1w、2w、4w、6w、8w进行BBB评分，评分者为非本实验组人员且熟知BBB评分标准。所得数据采用Student’s t检验进行统计学处理。9 P; P' ^; t5 ^
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斜板实验：将大鼠置于一块有纹理的斜板上，按大鼠身体轴线与斜板纵轴平行方向放置小鼠，斜板每次升高或降低的度数为5°，以大白鼠停留在斜坡上5秒的最大角度为其功能值，记下斜板度数。测量时间：三组分别在术前、术后1w、2w、4w、6w、8w进行，所得数据采用Student’s t检验进行统计学处理。
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1.6标本的制作麻醉同前，开胸，经左心室-升主动脉插管灌注，右心室切开放血，先用pH=7.4的PBS灌注，压力为85cmH2O，快速灌注150～200ml，待右心室留出无色清亮液体后，改用质量分数为10%的中性甲醛灌注150～200ml，其中前1/3快速灌注，后2/3缓慢灌注，至鼠体变硬时停止。原路显露并仔细咬除T7-T10棘突和椎板，取出脊髓，标记头尾端，置入质量分数为10%的中性甲醛中固定24h，以伤点为中心切取2cm脊髓，并将其分为3段，损伤近段5mm，损伤远段5mm，损伤段10mm，行石蜡包埋，损伤段纵形切片，损伤远近段作横行切片，片厚5μm，分别行HE染色及免疫组化染色。% K9 ?) y: A' P/ Q; J- g% E+ \
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& h1 d3 k. U R$ z 1.7免疫组织化学检测免疫组化检测方法(SABC法)如下：1） 切片脱蜡至水。2） 新鲜配制体积分数3 %过氧化氢孵育5min，灭活内源性酶。3） 微波修复抗原。4）滴加正常山羊血清20min，甩去多余血清。5）分别滴加1：100 N F，GFAP，Nogo-A室温2h，PBS洗2min3次。6）滴加生物素化二抗，室温30min，PBS洗2min3次。7）滴加SABC试剂，室温20min，PBS洗5min4次。8）DAB显色，光镜下控制反应时间，蒸馏水冲洗5min中止显色。9）苏木素复染1min，蒸馏水冲洗10min。10)常规脱水封片。
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1.8荧光显微镜检查BrdU免疫组化染色具体步骤是：1）玻片涂以防脱剂，自然干燥。2）石蜡切片烘片(60℃, 30min)。3)二甲苯脱蜡(210min)。4)经100％酒精至50％酒精梯度脱水后入蒸馏水。5）3％甲醇双氧水封闭(30min)。6）0.01mol／L PBS 漂洗(32min)。7）0.125％胰蛋白酶消化, 放室温下湿盒内 10min。8） 去离子水漂洗(32min)。9）加变性液100 μl／张(即用型，Zymed)30min。 10）PBS 漂洗(32min)。11）加封闭液 100μl／张(即用型， Zymed)10min。12）用滤纸吸除去封闭液。13）加生物素标记的鼠抗 BrdU抗体10μl／张(即用型，Zymed)。14）PBS漂洗(32min)。15）加链霉卵白素过氧化物酶复合物(即用型，Zymed) 30min。16）PBS漂洗(32min)。17）加DAB 混合液100μl／张(即用型，Zymed)。18）去离子水漂洗(32min)。19)苏木素淡染30 s。20)流水冲洗后，加入PBS直至返蓝。21)酒精逐级脱水, 二甲苯透明。22)中性树脂胶封片, 观察。
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3 b- `" ? Z# { 1.9统计学处理采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析及组间t检验。
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2结果
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2.1BBB评分与斜板实验和后肢行为学评分结果伤前各组BBB评分均为21分。伤后大鼠均表现为完全截瘫，后肢及尾无活动，排尿障碍，排便未见明显障碍。B、C两组大鼠后肢运动功能恢复较明显，B、C组注射细胞后2周开始出现后肢活动，逐步恢复排尿，伤后4周变化最为明显，可见明显后肢活动和尾巴的摆动，伤后8周，已可见协调运动，C组的恢复情况较B组为快，BBB最高评分可达14分，A组亦有所恢复，但程度较轻。三组变化过程相同，伤后各组8w评分较6w略有上升。B、C 两组评分高于A组，B、C两组统计学上有差异（P＜0.05）。C组与A组在6周以后的评分有显著性差异（P＜0.01）。斜板实验和后肢行为学评分与BBB评分类似。
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2.2荧光显微镜检查结果BMSCs在体外培养融合达到80%后，换液，加入含BrdU的培养基1h后，荧光显微镜下细胞核呈黄色。BMSCs移植后8w损伤处冰冻切片荧光显微镜下观察可见仍有散在的BrdU标记的细胞；移植细胞并向头尾两端迁移；灰质及白质均有分布。表明移植术后8周，移植的细胞仍存在于损伤部位并有迁移到宿主脊髓组织中的现象。
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2.3免疫组化结果A组切片见伤处为瘢痕连接，结构紊乱，邻近有明显空洞形成，未见神经轴索通过。B、C组亦见瘢痕形成，但可见少量神经轴索样结构。免疫组化显示：A组伤处邻近神经元胞体NF200阳性细胞较少，邻近脊髓组织GFAP阳性细胞亦较少。B组伤处可见GFAP及NF阳性纤维，但排列较紊乱，无正常结构。C组较B组邻近脊髓神经元胞体NF200阳性细胞较多，GFAP阳性细胞亦较多。C组大鼠脊髓损伤边缘Nogo阳性神经元较A、B两组明显减少。/ `7 M" Q: p8 J1 O. Y5 R4 G
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关于脊髓损伤的再生和修复能力问题，早期的观点认为，与周围神经不同，中枢神经损伤后无再生能力。但早在20世纪80年代，就有实验证明只要条件合适，一些中枢神经元在其轴突损伤后是可以再生的［3］。目前认为脊髓损伤后本身既有有利于功能恢复的方面，同时又有其不利方面。脊髓损伤后有利方面：1)残存的轴突（为完全损伤）仍然保留有功能；2)一些脱髓鞘的神经纤维可以自发的或相对容易的恢复某些功能；3)损伤区域远侧的大部分神经接头结构依然正常，这些正常的结构是局部反射功能（如胃肠反射和排尿反射等）恢复的物质基础； 4)很多成体的神经细胞在轴突损伤后并没有死亡，这些结构是神经再生的基础； 5)中间神经元在运动与经过上行、下行通路重新连接过程中具有潜在性的功能；6)局部微环境中有利于再生的因素。脊髓损伤后的不利方面：1)神经细胞的死亡：a：原发性损伤，b：继发性损伤；2)失神经后会导致细胞内的基因和分子的改变，而这种改变通常不易再生；3)脱髓鞘变化；4)局部脊髓组织瘢痕形成，阻碍神经纤维的通过；5)血供不良。 f. } F, }; b* ]) f( n
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0 Y0 S/ t) Q" X/ x# f 脊髓损伤后之所以再生困难是与缺乏合适的微环境有关，限制了脊髓神经元轴突再生能力。主要有2个方面：1）缺乏神经营养因子（NTFS)。NTFS是一类分泌性多肽，它由神经元靶区组织分泌后通过轴浆流逆行运输到达神经元、或通过自分泌和旁分泌方式作用于神经元，对神经元的结构功能发挥作用。现已经发现有30多种物质具有神经营养作用。神经纤维损伤后切断了细胞从它的靶器官或远端的胶质细胞获得足够的NTFS的来源。脊髓损伤后可观察到NGF, BDNF等及其受体mRNA水平明显上调，并且通过自分泌或旁分泌方式产生NTFS，但是其量远不足以维持其营养和存活来促进轴突断端的再生，因而如何增加受损脊髓区NTFS一直是研究热点。目前方法主要是通过直接注入，移植能产生NTFS的细胞或遗传工程修饰细胞等方法增加NTFS的含量［4］；2）局部抑制再生的一些分子。首先是与胶质瘢痕(filial scar)有关的，主要是硫酸软骨素蛋白聚糖类分子(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)。其次与髓鞘相关的，主要包括Nogo，髓鞘源性糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)。+ |6 A4 A3 Z J) v& E. D. }
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脊髓损伤后局部细胞的坏死，空洞形成，或瘢痕增生这些病理改变都会破坏脊髓的完整性，成为脊髓再生的障碍。人们自然想到植入组织团块来修复这些缺损。细胞移植治疗脊髓损伤的作用在于几个方面：1)作为神经信号传递桥梁。新植入的细胞可作为一个中转站将上级神经元的信息传递给远端脊髓的中枢样结构，从而调节远端肢体的功能。2)提供新的神经细胞。移植物可提供新的神经细胞，作为再神经化的源头，以修复损坏的神经通路。3) 提供神经营养因子。移植物可以提供多种神经营养因子，对修复有很大帮助。随着细胞生物学、生物化学与组织工程学的发展，目前可以分离培养用于移植的多种细胞，主要包括神经干细胞、胚胎细胞、雪旺细胞、嗅鞘细胞等。其中神经干细胞可以在损伤区内形成新的神经元以传递神经冲动并可形成新的神经胶质细胞以保护、支持新生轴突［5］ 。雪旺细胞及嗅鞘细胞主要是提供神经生长因子，提供合适的生长环境并促使新生轴突的再髓鞘化。胚胎神经组织移植可起到上述两个方面的作用。由于神经干细胞、胚胎细胞的取材困难，而且受到伦理方面的制约，其进一步应用于临床的可能性较小。: a, D; Z# T. s' g- r1 ^" S/ f
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5 P$ ^/ Z. D( C% P. r& `( @2 y
& b6 O9 ?+ D) `. P7 f 诸多实验报告骨髓间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、扩增迅速、可塑性强、离成熟细胞近和具有多向分化潜能，而且可以实现自体移植治疗，无免疫排斥问题和伦理之争等特点，已逐渐成为最具有临床应用优势的种子细胞，在创伤修复、组织或器官重建、退行性疾病、遗传性疾病、抗肿瘤、抗衰老等方面具有广阔的应用前景。国内国外都已有多位学者在体外实验中成功地将BMSCs诱导分化为神经样细胞并表达神经细胞特异性抗原［6］。上述结果提示了BMSCs可能是用于中枢神经系统损伤包括脊髓损伤修复的一种理想的细胞。
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目前最新发现某些免疫抑制剂亦有助于神经的恢复。他克莫司(tacrolimus，FK506)是一种大环内酯类抗生素，具有极强的免疫抑制作用。近年来，FK506在神经营养、保护方面的作用愈加引起人们的重视［7］。FK506与相应的受体结合蛋白-12(FKBP-12)结合形成FK506-FKBP复合物，该复合物具有介导免疫抑制作用［8］，可抑制T细胞的增殖、活化，减轻T细胞对损伤组织的破坏，从而对损伤局部的神经组织起保护作用。Kavmaz M 通过实验证实FK506在脊髓损伤后可以有效降低脂酯过氧化反应，减少多核白细胞趋化，抑制炎症反应［9］。有研究表明， FKBPs在中枢与周围神经系统中含量丰富，远高于在免疫系统中的含量［10］。Gold和Villafranca［11］认为，FKBP-52复合体对神经再生、神经保护具有重要作用。Asai等［12］的研究表明，FK506可减少脊髓损伤后神经细胞凋亡的发生。
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神经丝蛋白（Neurual thread protein，NF又称NTP)是神经元特有的结构蛋白，它特异性的分布于神经元的胞体及突起内，在胞体内多交叉成网。主要构成神经胞体和神经轴突的细胞骨骼框架并起维持作用，此外在轴浆运输中，对微管起协调作用。它代表了神经元的功能和联系。研究也发现神经丝与多聚核糖体关系密切，参与蛋白质翻译过程。在病理情况下(如损伤和缺血)神经丝发生降解，因此其表达水平能很好地反映神经元的病理变化。按其相对分子量的大小可以分为NF200，NF140，NF 68三种。其中NF200在正常情况下胞体不含或很少含有，故正常时NF200染色只显示轴索情况，而恢复期的神经细胞胞体内含有大量合成和积存的NF200的神经丝，故胞体亦着色。NF200与损伤修复的这种关系使其不仅能进行免疫组化形态学研究，也可以反应神经细胞的功能状态。本实验中NF200的阳性面积比也反应了轴突和胞体的功能状况，实验结果显示：移植组(B、C两组)的头尾两端的NF200阳性面积比与单纯损伤对照组（A组）有显著差异，损伤邻近部位的神经元着色深，胞体增大，突起增多。B、C两组没有明显差异，A组亦有上述改变，但程度较轻。脊髓损伤处BMSCs移植组可见NF阳性纤维，说明骨髓间充质干细胞移植有利于促进神经元功能活跃，激发了其内在的再生能力。
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6 F/ I5 z# q2 X 胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP） 是一种分子量为50 - 52KDa的酸性蛋白,属细胞骨骼蛋白，是星形细胞的标志蛋白，在星形细胞中有丰富的、唯一的表达。星形胶质细胞(Astrocytes ,AS) 是中枢神经系统主要的胶质细胞,中枢神经损伤后产生反应性星形细胞胶质化(Reactive astrogliosis)，表现为AS 增生、肥大，释放大量的神经营养因子(Neurotropic factors,NTFs) 有利于神经再生与修复，但亦会产生胶质瘢痕亦会妨碍轴突的延伸与再鞘。本实验观察到伤后8周C组损伤区可见较多GFAP阳性纤维，GFAP表达增高，阳性面积大于单纯移植细胞组，对GFAP的表达有明显的促进作用，而对照组损伤区GFAP着色少，胶质细胞退变明显。但有文献指出，AS的反应性胶质化具有双重性，一方面可以改善神经元存活的内环境促进脊髓的修复，另一方面产生过度，对神经再生起到机械化或化学阻挡作用［13］ 。本文认为，在损伤早期反应性角质化的增加可分泌大量促神经生长因子，有利于保持神经胶质细胞的功能，改善脊髓修复的内环境，减轻了宿主脊髓神经胶质细胞调亡，减少SCI的继发损伤。 i% M* m* ~( D% ~, Y8 H
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Nogo长期以来，胶质疤痕都被视为轴突再生的障碍，但是最初是被看作一种物理性的障碍。目前认为疤痕中的某些分子抑制轴突再生，主要是硫酸软骨素蛋白聚糖类分子(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)，体外试验中，CSPG的很多成员，都抑制轴突生长［14］。在1988年, 瑞士的神经生物学家Schwab领导的研究小组首次报道了由髓鞘细胞分泌的抑制分子的存在，直到2000年， Schwab和美国耶鲁大学的Strittmatter的实验小组用不同的方法克隆了这个蛋白的基因, 并且给这一基因形象的命名为Nogo， Nogo蛋白具有强烈的中枢神经生长抑制活性。其中Nogo-A 是一种髓鞘相关轴突生长抑制因子，由少突胶质细胞表达，贮存于中枢神经系统(CNS) 富含髓鞘膜的白质中。用抗体中和Nogo-A 可以促进脊髓损伤大鼠的运动功能恢复。目前一致认为，Nogo-A是CNS髓磷脂神经元轴突生长抑制因子。实验研究表明通过拮抗Nogo蛋白的抑制作用能有效的提高中枢神经的再生功能，这在临床上无疑具有重大意义。本实验中，C组大鼠脊髓损伤边缘Nogo阳性神经元较A、B两组明显减少，说明FK506可能有抑制局部疤痕形成的功能。
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本实验结果表明：大鼠脊髓损伤后移植大鼠骨髓间充质干细胞在脊髓损伤部位能长期存活，并能向邻近脊髓内迁徙；骨髓间充质干细胞移植对于脊髓损伤的大鼠后肢功能的恢复有促进作用，联合应用FK506有协同效果。但由于本实验动物例数不多，且脊髓损伤功能恢复需要一个多种神经因子共同参与的复杂的微环境，能否同时联合其它有利于脊髓功能恢复因素，抑制其不利因素来协同治疗脊髓损伤需进一步研究。
: r. a4 p9 w- Z 【参考文献】& i! M1 U) i) b9 E2 b
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