脐带血干细胞移植治疗急性心肌缺血的实验研究

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作者：李春海作者单位：河北北方学院附属第二医院内科，河北 张家口  075000 9 V2 V' k+ Q5 ]
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2 I9 e% Z# e) F2 f" v9 k          【摘要】  目的：利用人脐带血干细胞移植治疗兔急性心肌缺血，探索防治缺血性心脏病的新方法。方法：新西兰白兔40只，雌雄不拘。随机等分为实验组和对照组。两组均结扎冠状动脉左前降支中1/2，复制心肌梗死模型。缺血60min后将0.3ml的108/ml人脐带血干细胞注射到实验组兔的缺血区心肌组织，对照组兔缺血区心肌组织中注射等体积的人静脉血。3周后观察心功能、心肌梗死面积和心肌生化指标。结果：实验组的LVSP和左心室最大变化速率均明显高于对照组（P＜0.    01），而LVEDP显著低于对照组（P＜0.    01）。实验组的心肌梗死面积明显小于对照组（P＜0.    01），血清CK和MDA的含量也显著低于对照组（P＜0.    01），SOD含量则明显高于对照组（P＜0.    05）。结论：人脐带血干细胞移植能够明显改善兔急性心肌缺血的心功能，减轻氧自由基对心肌的损伤，缩小心肌梗死面积。 0 U! P8 o8 i$ [0 X' J
          【关键词】人脐带血干细胞 移植 治疗 急性心肌缺血3 Z2 c0 ?: L( z
                  Laboratory Study on Acute Myocardial Ischemia Treated by Transplantation, \- H  J& X/ L

% y* I9 m) R. E9 U4 @: Xwith Human Umbilical Cord Blood Stem Cells1 ]) B! @) \+ P: @

2 }+ g3 H; c% Q$ ?8 xLI Chun-hai& w& E1 z4 y  x1 f, W

% W" `7 p+ \3 h- b0 cDepartment of Internal Medicine, the Second Affiliated Hospital,5 c7 J8 X! q" Y+ r* A

8 t  h9 \& W/ l# kHebei North University, Zhangjiakou,075000, China
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# _# R" s6 H. ]【ABSTRACT】Objective: To investigate a new method to cure acute myocardial ischemia with human umbilical cord blood stem cells (HUCBSC) transplantation. Methods: 40 New Zealand rabbits were randomly divided into two groups-intervention group and control group. The left anterior descending branch of coronary artery was ligated to construct acute myocardial ischemia model. After 60-minute ischemia of the myocardium, 0.3ml of HUCBSC (the concentration was 108 cells per milliliter) was transplanted into the ischemic myocardium of rabbits in intervention group, while the same volume of human vein blood was transplanted into the ischemic myocardium of rabbits in control group as well. 3 weeks later, the myocardial function, the myocardial infarct size, creatine kinase（CK）, malondialehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）concentration in serum of both group were investigated. Results: Left ventricular systolic pressure (LVSP) and ±dp/dtmax of left ventricle of rabbits in intervention group were much higher than those in control group (P＜0.01)，however, left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) of rabbits in intervention group was lower obviously than that of control group (P＜0.01). The myocardial infarct sizes of rabbits in intervention group were smaller than those in control group (P＜0.01), the serum concentration of CK and MDA of rabbits in intervention group were lower in evidence than those in control group (P＜0.01), while the concentration of serum SOD in rabbits of intervention group was higher than that of control group (P＜0.05). Conclusion: Transplantation of HUCBSC can improve myocardial function, abate myocardial injury due to oxygen free radicals and reduce myocardial infarct size of ischemic myocardium in rabbit.
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【KEY WORDS】Human umbilical cord blood stem cells; Transplantation; Treatment; Acute myocardial ischemia
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急性心肌缺血是临床上缺血性心脏病的主要病理生理过程，而缺血性心脏病是目前的常见病和多发病[1]，尽管现代医学已有许多方法防治本类疾病，但效果并不十分理想。本研究利用脐带血干细胞移植治疗急性心肌缺血，旨在探索防治缺血性心脏病的新方法。
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% y7 C' f' y% k* w  i1资料与方法
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& P- L5 i) [- i+ x% J" e3 }1.1脐带血干细胞分离无菌条件下，密闭式采血，用肝素抗凝（20U/ ml），收集母体健康的正常足月顺产儿的脐血6份。肝素抗凝的脐血用Ficoll作密度梯度离心获得脐血单个核细胞（MNC），洗涤后用RPMI 164调整细胞浓度为1(108/ml。采用Isolex50免疫磁珠分离系统，即用5%静脉用丙种球蛋白阻止非特异性结合，加CD34 单抗（Baxter）混匀洗涤后加入磁珠，反复洗涤后加酶切试剂（Baxter），洗涤后收集细胞。用流式细胞仪测定CD34 细胞纯度。/ c, `  x" X. x# m' L
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1.2动物实验新西兰白兔40只，雌雄不拘。随机等分为实验组和对照组。两组均结扎冠状动脉左前降支中1/2，复制心肌梗死模型（由肢体Ⅱ导联ECG决定是否发生MI）。缺血60min后将0.3ml的108/ml人脐带血干细胞注射到实验组兔的缺血区心肌组织，对照组兔缺血区心肌组织中注射等体积的人静脉血，无菌条件下缝合心包，关闭胸腔。3周后由颈动脉插管至左心室检测左心室收缩压（LVSP）和左心室舒张末期压（LVEDP），并计算左室压力最大变化速率（±LVdP/dtmax），同时观察ECG。
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1.3心肌梗死范围的测定实验结束后取出心脏，位结扎左冠状动脉主干，经主动脉逆行灌注0.5% Evan’s蓝2～ 3ml，分离无蓝染缺血区和蓝染非缺血区，将无蓝染缺血心肌以滤纸吸干后置于-20℃冰冻20分钟，垂直其长轴水平切片，每片厚1～ 2mm，置入1%TTC 磷酸缓冲液（pH=7.4）中37oC孵育20min，此时坏死区（necrotic zone，NZ）呈灰白色，非坏死区（no-necrotic zone，NNZ）呈深红色，其后将NZ和NNZ分离，滤纸吸干，置于AB104-N天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司生产）上称重。梗死范围以坏死心肌重量与缺血心肌重量（坏死区与非坏死区之和）之比表示。& ?" B& h" V  x' d
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1.4生化指标测定实验结束后，打开腹腔从下腔静脉抽取静脉血4ml，以4500转/min分离血清，-20℃保存待测。检测血清磷酸肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）（试剂盒购自南京建成生物工程研究所），严格按说明书操作。/ M, x) G7 M& j

& C5 i1 m9 |& O" e! n% }3 A1.5统计方法所有数据经Excel 2000 软件统计处理。计数资料以绝对值和百分比表示，计量资料以均数±标准差( x±s) 表示。计数资料用χ2检验，计量资料用方差。
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3 ~+ h; p- I& G2 M; Z2结果: B) a: \1 ]- y: X. J8 A3 \, y, A' V

8 `+ ^( d+ m% i3 o$ f2.1心功能情况实验组新西兰兔的LVSP（218.6±41.3）mmHg明显高于对照组（164.4±39.8）mmHg（P＜0.01），实验组新西兰兔的LVEDP（12.6±8.5）mmHg显著低于对照组（21.5±9.1）mmHg（P＜0.01）。实验组兔的左室压力最大上升速率（ LVdP/dtmax，516.3±87.9mmHg/s）和最大下降速率（-LVdP/dtmax，475.1±91.2 mmHg/s）显著高于对照组（ LVdP/dtmax，211.7±56.4mmHg/s；-LVdP/dtmax，163.9±64.8 mmHg/s）（P＜0.01）。
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$ a/ `: E, N/ o( E3 g& p2.2心肌梗死面积实验组与对照组心肌梗死面积比较显示，实验组梗死组织重量百分比显著小于对照组（P＜0.01），表1两组心肌梗死面积 注：实验组与对照组相比，★P＜0.01/ L8 Q* j3 @! v: W
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2.3血清生化指标实验组与对照组比较，实验组MDA和CK浓度明显低于对照组（P＜0.01），而SOD浓度明显高于对照组（P＜0.05）。表2两组CK、MDA、SOD的浓度注：实验组与对照组相比，★P＜0.01，▲P＜0.05* r& Y6 x6 C! Y! D) x7 H1 Y

( f1 }" }7 I+ x9 S! ]: w  _2 k- t3讨论
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+ s3 v# g+ j3 i! V' D% r, T; T心肌缺血是临床上的常见病和多发病，目前对于心肌缺血的治疗仍主要靠药物。本研究利用人脐带血干细胞移植到缺血区的心肌组织，目的在于探索心肌缺血新的治疗方法。
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! n2 M; |' T9 `* X从本研究的结果来看，脐带血干细胞移植能够明显改善兔急性心肌缺血后的心功能，升高LVSP，降低LVEDP，增加心室的顺应性，同时显著缩小心肌梗死的面积。% |' M- B5 W7 `8 x$ o- H4 g

& b; E0 U1 a& o; n/ K" \  b) R& `心肌缺血时, 机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，使氧自由基的生成增加。氧自由基对心肌的损伤主要表现为脂质过氧化作用，即氧自由基与心肌细胞膜上的多不饱和脂肪酸结合，引起脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物（lipid peroxide，LPO），引起细胞结构和功能的一系列改变，最终导致心肌细胞的损伤[2]。体内最重要的LPO代谢产物是丙二醛（malondialehyde，MDA），故测定MDA能较好地反映组织脂质过氧化程度，间接反映出细胞损伤程度。氧自由基清除酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶等的活性降低时，导致氧自由基堆积，氧自由基可转变为羟自由基，其活性更强，使膜脂质过氧化，引起细胞膜的结构和功能损害，细胞膜结构遭自由基及脂质过氧化破坏后，可使细胞膜功能失调，进一步促进Ca2 内流增加，造成细胞Ca2 超载，激活Ca2 依赖蛋白水解酶，促进氧自由基生成，从而加剧缺血组织损伤[3]。SOD是体内清除自由基的一种特异酶，其活性变化可反映体内抗氧化功能情况[4]。本研究显示，脐带血干细胞移植后，实验组的CK和MDA含量较对照组明显降低，而SOD含量明显增高，提示降低MDA含量、增强SOD活性是脐带血干细胞移植减少心肌缺血所致心梗面积的可能机制之一。
( d* Z: X% O& E7 C          【参考文献】+ T$ p$ r& h3 C! A" G
1.Kaul S, Ito H. Microvasculature in acute myocardial ischemia: part II: evolving concepts in pathophysiology, diagnosis, and treatment［J］. Circulation，2004，109(3):310-315/ o# z) S; [0 l! y2 T% y: V) Z* \

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% G/ G7 V1 c# W+ X( Q1 ?
    2.Hale SL, Kloner RA. Myocardial hypothermia: a potential therapeutic technique for acute regional myocardial ischemia［J］. J Cardiovasc Electrophysiol，1999，10(3):405-413" ^' ]( W; B( Z- H. u" L  L
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    3.Carvajal K, El Hafidi M, Banos G.Myocardial damage due to ischemia and reperfusion in hypertriglyceridemic and hypertensive rats: participation of free radicals and calcium overload［J］. J Hypertens，1999，17(11):1607-1616  u7 n0 v5 ?- s$ z/ I; |6 g
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    4.Mehta JL, Chen H, Li D, et al. Modulation of myocardial SOD and iNOS during ischemia-reperfusion by antisense directed at ACE mRNA［J］. J Mol Cell Cardiol，2000，32(12):2259-2268

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