血管内皮生长因子对骨髓间充质干细胞分离培养的诱导分化作用 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:33 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：杜建时  赵晴  张英丽作者单位：吉林大学中日联谊医院血管外科，吉林  长春  130030
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      【摘要】  目的  结合骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子(VEGF)的优点，探讨VEGF对其体外诱导分化的作用。为缺血性疾病的治疗提供新思路。方法  成人新鲜骨髓，Percoll梯度分离法培养，单克隆培养法分离传代扩增骨髓基质细胞(MSCs)。在大肠杆菌DH5α中扩增和提取，纯化、克隆pcDNA30VEGF165质粒。脂质体法转染MSCs。流式细胞术检测诱导前后MSCs免疫表型变化。一抗VEGF和CD31（1∶50），FITC标记的VEGF二抗和cy3标记的CD31二抗与细胞共同孵育，甘油封片，在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞染色情况。结果  转染前表达CD44（7586%）、CD31(563%)。转染后CD44表达明显下调（4018%），CD31则明显上调（5620%）。FITC标记后VEGF抗体使细胞显现绿色荧光，cy3标记的CD31抗体使细胞显红色荧光。结论  转染VEGF后骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化且有分泌VEGF的功能，为干细胞植入及血管再生起到指导作用。 ; w; s9 ^6 v& F- n; ~
      【关键词】骨髓间充质干细胞；血管内皮生长因子(VEGF)；基因转染
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　　骨髓间充质干细胞来源广泛，易于取材分离培养，体外扩增能力强〔1，2〕，可分化为多种组织，易于外源基因的转染和表达〔3〕，因而被认为是细胞治疗和基因治疗理想的靶细胞。血管内皮生长因子(VEGF)促进血管形成的功能早已被诸多研究证实〔4，5〕，但生物半衰期短,疗效短暂。目前,国内外学者对骨髓基质细胞(MSCs)的组织工程学应用研究较多，多将MSCs诱导分化为骨、软骨、脂肪等组织细胞〔1～3〕，而对于MSCs的内皮分化功能研究较少。本实验旨在结合骨髓间充质干细胞与VEGF的优点，以骨髓间充质干细胞易于外源基因转染和表达，抵消VEGF生物半衰期短需要基因转移治疗这一缺点进行了研究，分离和培养人的骨髓间充质干细胞，用带有VEGF165的质粒转染人的骨髓间充质干细胞，从而探讨VEGF对其体外诱导分化的作用。为以后的体外动物实验提供前期基础和一个可行的平台，为缺血性疾病的治疗提供新思路。; b: H+ I0 v: A' R% E6 j+ N
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　　1材料与方法3 G% g' K, \3 |

　　11骨髓间充质干细胞的原代培养5 ml成人新鲜骨髓加入5 ml含10%的胎牛血清LDMEM培养液混匀，1 200 r/min 8 min，收集沉淀。加10%的胎牛血清的LDMEM培养液至5 ml，充分混匀。取另一无菌离心管，加5 ml 1073 g/ml的Percoll液，将第一个离心管内的液体加到Percoll细胞分离液上。2 500 r/min，30 min离心，吸取单核细胞层，加适量含10%胎牛血清的LDMEM的培养液，混匀，接种于24孔板，每孔加入含10%胎牛血清的LDMEM细胞培养液至2 ml，37℃，5%CO2培养箱，饱和湿度条件下培养。8 f7 N0 ~1 t! n
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　　12骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞培养增殖至接近融合状态时， 025%胰蛋白酶300 μl消化2～3 min，胎牛血清的培养液中止消化，轻轻吹打使细胞脱壁，按1：3的比例，将细胞置于3个培养孔内，加适量10%胎牛血清LDMEM培养液，继续培养。* M# q- m: v) b0 x" x& @8 V2 V

　　13MSCs的体外VEGF基因转染5 r; ?* E- c5 G, _
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　　131质粒获得与测序pcDNA30VEGF165质粒由沈阳联星鞠险峰经理惠赠。目的基因共576个碱基与基因bank上查得的VEGF165基因序列完全相符，证实该质粒上连接的目的基因确为VEGF165。8 p  U+ ], ?1 a
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　　132在原核细胞中复制扩增和克隆化pcDNA30VEGF165质粒制备大肠杆菌DH5α感受态细胞进行转化和氨苄青霉素筛选。在含氨苄青霉素的500 ml LB培养液中继续培养，提取纯化。
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　　133转染025%胰酶消化1～2 min，含胎牛血清的LDMEM培养基吹打，转移到24孔培养板，完全培养液37℃，5% CO2培养18～24 h。质粒06 μg稀释于30 μl LDMEM。2 μl梭华Sofast稀释于30 μl LDMEM中混匀。30 μl梭华Sofast稀释液滴加到DNA稀释液中。室温15～20 min。60 μl梭华Sofast/DNA复合物加到每孔混匀。37℃，5%CO2孵育箱48～72 h。加入2 ml含500 μg/ml G418的10鸖新鲜培养液，继续培养。. E: Y( O; T" t% D" P' u  I& l) z
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　　14分组免疫荧光染色鉴定共分质粒空载MSCs组，转染了pcDNA30VEGF165的MSCs组和未转染的MSCs组3组进行。细胞爬片蒸馏水化20 min，01%TritonX100作用10 min，01 mol/L PBS冲洗5 min3次，3%内源性过氧化物酶阻断20 min，01 mol/L PBS冲洗5 min3次，血清封闭30 min，滴加一抗VEGF（1∶50）4℃过夜，在振荡器上用01 mol/L PBS冲洗5 min3次，滴加FITC标记的二抗，常温避光反应30 min，在振荡器上用01 mol/L PBS冲洗5 min3次。用甘油封片，在激光扫描共聚焦显微镜下观察。

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　　将转染了pcDNA30VEGF165的MSCs组细胞爬片用蒸馏水水化20 min，01%TritonX100作用10 min，01 mol/L PBS冲洗5 min3次，3%内源性过氧化物酶阻断20 min，01 mol/L PBS冲洗5 min3次，血清封闭30 min，滴加一抗VEGF和CD31（1∶50）在4℃下共同孵育过夜,在振荡器上用01 mol/L PBS冲洗5 min3次，滴加FITC标记的VEGF二抗和cy3标记的CD31二抗，常温避光反应30 min，在振荡器上用01 mol/L PBS冲洗5 min3次。用甘油封片，在激光扫描共聚焦显微镜下观察。

　　15转染前后骨髓间充质干细胞的免疫学表型的测定025%胰酶消化收集第3代MSCs， PBS液洗涤，与浓度为1∶30,PE标记的抗CD44、CD29、CD31、CD34、CD45抗体4℃孵育50 min，PBS液洗涤，001 mol/L PBS悬浮，流式细胞仪检测蛋白变化，以PBS代替一抗作阴性对照。0 A* ?8 k: v5 w( ^0 q9 c7 p

　　16统计学处理数据用x±s表示，采用SPSS100进行单因素方差分析及t检验。
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　　2结果

　　21免疫荧光染色鉴定转染了pcDNA30VEGF165的MSCs组呈现绿色荧光，质粒空载MSCs组和未转染的MSCs组则不显色。用FITC标记的VEGF抗体使细胞显现绿色荧光，说明转染了pcDNA30VEGF165后的MSCs可表达VEGF。用cy3标记的CD31抗体使细胞显现红色荧光，说明转染pcDNA30VEGF165的MSCs的细胞表型发生变化，表现了内皮细胞的表型即CD31，两个抗体共同孵育时，细胞既有绿色荧光又有红色荧光(图1)，说明转染pcDNA30VEGF165的MSCs既具有内皮细胞表型同时又可表达VEGF。
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　　图1VEGF、cy3双抗体阳性荧光染色（400）（略）1 g7 }. s/ `5 [
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　　22骨髓间充质干细胞的免疫学表型的测定非转染组：CD44（7586%）、CD31(563%)。转染组CD44表达明显下调（4018%）（P＜005），CD31则明显上调（5620%）（P＜005），MSCs 呈现典型的内皮细胞表型。! i6 @: T9 X, j1 _5 A
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　　3讨论

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　　VEGF促进血管形成的功能早已被诸多研究证实，其为血管形成的主要调控因子，在体内实验中，它可直接诱导新生血管形成〔5，6〕。在体外实验中，VEGF可刺激血管内皮细胞分裂和增殖，诱导其迁移和形成管腔样结构〔7〕。并且增加细胞外基质，从而诱导血管发生。由于VEGF生物半衰期短，疗效短暂，人们开始考虑应用VEGF基因转移治疗。
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　　本实验采用简单易行的密度梯度分离法培养MSCs，将Percoll分离液的密度调至1073 g/ml，获得的细胞均一性好。用含10%胎牛血清的LDMEM作为培养MSCs的培养液。因为血清浓度过低不利于细胞的生长，而高浓度血清则易引起细胞分化，影响其生物学特性，使细胞过早老化〔8〕。本实验证明，应用此浓度的培养基，细胞生长状态良好，可传数代而无明显衰老迹象，同时也进一步验证了密度梯度分离法这一经典的培养方法。CD44是造血干细胞表面所没有的，CD31作为造血干细胞的表面标志抗原则呈阴性表达，说明了培养的细胞不是骨髓中另一大类细胞即造血干细胞，而是骨髓间充质干细胞，同时，由于CD31为内皮细胞的特异性表面标志，骨髓间充质干细胞应为CD31阴性表达。
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　　VEGF为内皮细胞的有丝分裂原,可刺激血管内皮细胞分裂和增殖，增加细胞外基质，诱导血管发生〔4～6〕。本实验用带有VEGF165基因的质粒采用脂质体转染法转染MSCs后发现，转染后的MSCs细胞表型发生明显转变，CD31表达率明显增高，呈现典型的内皮细胞的表型特征，这说明MSCs具有向内皮细胞分化的潜能，同时，本实验用带有荧光标记的VEGF抗体与转染后的MSCs共同孵育后，在激光扫描共聚焦显微镜下观察，发现细胞显示绿色荧光，说明转染后的MSCs表达VEGF。这就为血管组织工程学提供了良好的种子细胞，在缺血性疾病和器官缺损疾病的治疗中发挥作用。

      【参考文献】
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