请问大家通过免疫组化检测细胞中marker蛋白时用什么方法？

zhaonicholas

大家好，最近我在设计自己的实验，其中需要用免疫组织化学法来检测细胞中特定marker蛋白的表达，但是由于以前没做过细胞的免疫组化，因此在这里请教大家，请做过细胞免疫组化特别是神经细胞免疫组化的大侠来谈谈你们常用的方法。谢谢了！！

stemcellfamily

将你需要检测的目的蛋白作为抗原，在网上搜索到相对应的抗体。按照正常的免疫组化操作步骤来做。免疫组化本来就是这用途的

流云阿凯

主要还是注意一下所做细胞的状态以及各个步骤的时间控制，还有如果所买抗体不是工作液的话，要注意一抗的稀释倍数，避免出现假阳性！整个过程除打孔和除内源性氧化酶外，最好都放置在37°C温箱内。另外，做细胞的话可以种板直接在板内做免疫组化，也可以做板内的爬片，固定后把片拿出，放于载玻片上，再做后续的步骤！

zhaonicholas

回复 3# 流云阿凯 + \5 G! B2 v! c, b8 R0 P
4 q! n5 }; Y% }  u% P- S) D! N
谢谢你！请问打孔和去除内源性氧化酶的详细过程是？我对这个不是很明白。另外板内做免疫组化的话用显微镜观察方不方便？

zhaonicholas

回复 2# stemcellfamily 4 W+ {# T7 h( h) e

# ]. D+ ~5 \) k" O3 T
3 {4 r- N# z# ~7 ]8 _. i& ?    谢谢！我问的是细胞免疫组化~~它跟组织的免疫组化肯定有区别

jhu132llh

做细胞的免疫组化步骤：% f) z$ b. f- ^8 h* h2 p1 r
1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色
- m& o% S( Y1 w$ d$ Q9 [     细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片- A+ A: \! Y3 T' A; G+ [% G" ]
    细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。0 m1 W' a/ g# V( E+ u! C! o
    其实小的well的话，可以直接拿来染色，没问题的。
* m# t% p; v5 ]4 p2 P  k2.固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。。。）固定细胞。$ k& z2 u; M3 l" e0 k8 ?! R1 |
3.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。
5 F* S7 w# M7 l1 q# w3.通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），一般选用Triton-X100来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。. T* I1 k& H+ k  ?  Y
4.封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。; h( {1 K" X0 u' x7 c
5.一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。
' ?$ n* r& `+ \/ c& d3 k& l, l6.洗去一抗。
) N4 x3 O3 w# N% `" @- _7.上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。
5 Y9 N% k0 @' S. Y8.底物显色（选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做）# N* e" b; ?; H
9.洗去二抗，染核2 w- O) ?' p2 \: V) z- F8 r2 s
  DAPI或者Hoechst染核3 [0 o: W$ v+ }% G" q& G2 v
10.洗去染核液，加PBS，上镜观察。

jhu132llh

以上是我个人的实验总结
8 m- @6 w8 m& }( _& @小弟做免疫组化差不多有两年了( D, q( G% w! P4 s8 {% q
基本上按这个做事没什么的问题的
# J2 }2 h4 h3 U5 n关键在于：
% ?5 F6 ~  N) [# P6 ~8 N0 b3 Z* B1.选取一个合适的抗体，这一点，你咨询抗体公司，尤其是国外的抗体公司，一般他会给你一个满意答案的。; v5 c0 {. V3 I, s; j
2.在于固定液的选择，具体的细胞可能对固定液会有点选择，摸索一下就可以。
  n- Y3 H* f6 ~+ K8 I4 S+ U( f9 o3.在于通透火候的掌握，这个在于反复摸索。
4 a% ]5 ?- E7 c6 R% b( C4.一抗的稀释浓度，这个尤其需要反复摸索，以其避免假阳性出现5 Q3 E' o$ u, U+ j
5.照相技巧，照出一张好张片是需要好的技巧的。

痞子的烟头

上面说的都很好，还有一点，单染与双染所用的封闭血清是不同的

zhaonicholas

回复 7# jhu132llh 6 c) g8 g! L( U. `+ L4 y) \
; b6 r$ `3 [: X0 A4 B  r; v
- l4 ^8 Z5 N3 G- I
    哥们，很谢谢你啊，这个我看了你写的内容真的是有如醍醐灌顶！！以后我们多多交流！！

zhaonicholas

回复 8# 痞子的烟头
4 b# H" x# _+ F( w% h9 V: m/ i" R
哥们，单染与双染分别是指什么？请赐教，谢谢