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作者：于长海， 刘颖，李捷，张宜明，俞建琦作者单位：解放军总医院第一附属医院胸心外科， 北京 100037 1 I) |3 J6 D- n7 G5 p
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【摘要】 目的： 探讨体外分化的小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌组织单个心肌细胞获取方法. 方法： 用胰酶、胶原酶溶液消化乳大鼠心室肌组织及小鼠胚胎干细胞源心肌细胞，获得细胞悬液经Percoll分离纯化后，再低密度接种富集的心肌细胞，通过光镜观察获得的单个跳动的心肌细胞，采用免疫组织化学和激光共聚焦方法鉴定心肌细胞. 结果： 乳大鼠心室肌组织及小鼠胚胎干细胞源心肌细胞用胰酶、Dispase酶消化，经Percoll分离纯化后，能获得纯的单个心肌细胞，光镜下单个心肌细胞收缩明显而有力.免疫组织化学和激光共聚焦观察发现单个心肌细胞中有肌原纤维束. 结论： 使用胰酶、Dispase酶消化后，经Percoll分离纯化可从体外分化小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌组织获得活性良好的单个心肌细胞.
" k" B# N- J5 y/ w, A, n 【关键词】小鼠; 胚胎; 干细胞；心肌/细胞学；细胞培养技术
# ~% l% \( V/ n6 h Method to get single cardiomyocyte from embryonic stem cells differentiated in vitro and neonatal rat ventricular tissues) D( }( `1 D+ n, j4 J3 `3 k& u
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YU ChangHai, LIU Ying, LI Jie，ZHANG YiMing, YU JianQi
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6 U# B2 P+ K" `) i2 Q# H0 G Department of Cardiothoracic Surgery, First Affiliated Hospital, PLA General Hospital, Beijing100037, China; m$ S& n8 k5 L! _3 M' _( u
4 Q J/ i: o$ F 【Abstract】 AIM：To find a method to get single cardiomyocyte from mouse embryonic stem cells(mES cells) differentiated in vitro and neonatal rat ventricular tissues. METHODS: Neonatal rat ventricular tissues anddifferentiated mouse embryonic stem cells were digested by trypsin and dispase. After discontinuous Percoll gradient centrifugation, the enriched cardiomyocytes were planted at a low concentration. Cardiomyocytes were observed and identified by light microscope and immunohistochemistry and confocal laser scanning microscopy(CLSM). RESULTS: After discontinuous Percoll gradient centrifugation, the enriched cardiomyocytes were arranged in loose and interlacing networks of single cells. The single cardiomyocyte beat spontaneously under light microscope. and exhibited strands of elongated and well developed myofibrils. CONCLUSION: This method could get single cardiomyocyte with good morphology and vitality from defferentaited mES cells and neonatal rat ventricular tissues.+ C& v3 J0 e4 u* ?/ y3 R
4 t! t8 g" T& \' n+ |9 c5 }* ~3 _6 e 【Keywords】mic embryo; stem cells; myocardrum/cytology; cell culture techniques
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0引言
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目前，由于缺少能模拟心肌细胞发育的心肌细胞系, 并且早期胚胎心脏太小, 心肌细胞是怎样由它的前身细胞分化而来，心肌基因表达及不同离子通道的功能表达之间的关系以及形态和离子通道调控变化的关系等研究受到阻碍.随着胚胎干细胞的研究及技术发展, 以上各项研究都可利用从多能小鼠胚胎干细胞在体外分化成心肌细胞的模型加以研究.我们将介绍体外分化小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌组织单个心肌细胞的获取方法.
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0 h% v7 c. C& @: {* v" I' P 1材料和方法
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. D) @5 x' ~! E. j; c k6 A 1.1材料
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复苏mES细胞（ESD3细胞）、FBS（购自北京元亨圣马生物技术研究所）；谷胺酰胺、庆大霉素、β巯基乙醇、非必需氨基酸、胶原酶溶液（Dispase酶）（均购自Sigma公司）；旋转生物反应器（Rotary Cell Culture System，RCCS）；抗心肌肌钙蛋白T抗体（1∶100）、抗大鼠IgG（购自博士德公司）；生物素标记的羊抗小鼠试剂盒（购自中杉金桥公司）；辣根标记的链霉卵白素、DAB试剂盒（购自中山试剂公司）.
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1.2方法
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1.2.1未分化mES细胞的培养复苏mES细胞(ESD3)，离心弃去DMSO 培养液, 于ES细胞未分化培养液，即150 mL/L FBS，2.2 g/L NaHCO3，2 mmoL/L谷胺酰胺，庆大霉素4万U/L，0.1 mmoL/Lβ巯基乙醇, 0.01 mmoL/L非必需氨基酸, 100万U/L LIF(Gibco)的HDMEM中重悬，接种到丝裂霉素C 处理过的、已经失去有丝分裂活性的滋养层细胞的3 cm培养皿中，每皿完全培养基5 mL.细胞密度约1109/L. 37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养，第2日更换培养液，继续培养.
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/ N* z+ Q' d8 d v2 V9 s5 M 1.2.2mES细胞的分化培养; k8 f a4 D' i/ @
4 t( B8 E7 T3 `9 Y: e 1.2.2.1旋转生物反应器制备拟胚体（EBs）取对数生长期小鼠胚胎干细胞（ESC），经2.5 g/L胰酶 0.4 g/L EDTA消化后制备为细胞悬液，细胞计数后以107/L细胞密度种植入经无菌处理的容量为110 mL的RCCS（STLV型）内，并补充培养基至充满整个容器.将整个装置置于CO2培养箱内，37℃条件下常规培养. RCCS的初始转速为10 r/min，随着EBs的形成及其体积的不断增加，调节转速至15～20 r/min以维持EBs的悬浮培养状态.
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1.2.2.2mES细胞定向分化培养为心肌细胞将经RCCS制备5 d的拟胚体转移到含ES细胞分化培养基，即200 mL/L FBS，2.2 g/L NaHCO3，2 mmol/L谷胺酰胺, 庆大霉素4万U/L，0.1 mmol/L β巯基乙醇, 0.01 mmol/L非必需氨基酸，5 mg/L 抗坏血酸(Sigma)的HDMEM培养液的组织培养皿(Nunc)中，接种密度为1～3 EBs/cm2, 令EB贴壁生长，分化为心肌细胞［1-2］.
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1.2.2.3ES源心肌细胞的收集［3］ES细胞经悬浮培养形成EB，EB接种贴壁后经抗坏血酸诱导，7 d时把分化的ES细胞用2.5 g/L胰酶 0.4 g/L EDTA轻微消化，终止后用吸管轻轻吹下, 置于离心管中，轻微离心2 min，去上清，加入胶原酶溶液，置于37℃, CO2孵箱中20 min，轻微离心，去上清，加高K 溶液，用吸管吹打，等组织块被消化完，200目网过滤后，1200 r/min，离心5min，去上清，加200 mL/L FBS的DMEM至3 mL备用.( c& [" @- o" Y2 T5 u1 f( u
( S2 l7 O4 X5 C: w0 O. U% b 1.2.3乳大鼠心室肌组织心肌细胞的分离按文献［4］的方法分离，细胞离心收集后，加完全培养基，即200 g/L FBS的HDMEM（Gibco）（含NaHCO32.2 g/L, 谷胺酰胺0.2923 g/L, 庆大霉素4万U/L）至3 mL备用.+ R! P; W" n2 @6 s
/ y- [% T$ `$ E- }4 f- ] 1.2.4Percoll纯化和心肌细胞培养405 g/L的Percoll 3 mL缓慢地加到585 g/L的Percoll上面，再将3 mL收集的ES源心肌细胞或乳大鼠心室肌组织心肌细胞轻轻地加到顶层，1500 r/min离心30 min. 收集分离的第五层细胞，用PBS洗2次，离心去除Percoll后，加培养基重悬，即低密度接种于24孔板中，每孔置一预先用1 g/L的明胶包被的10 mm10 mm盖玻片.置于37℃，50 mL/L CO2孵箱(Forma)中培养.细胞贴壁后每天观察两种来源心肌细胞在体外培养期间的形态、开始跳动的时间、跳动频率等情况.
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4 s, K8 v: h' t# ~ 1.2.5心肌细胞的鉴定$ J( ]$ b2 I( W
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1.2.5.1免疫组织化学染色Percoll分离后培养3 d的细胞，经PBS清洗2次，丙酮固定后用抗肌钙蛋白T抗体作免疫组化鉴定.细胞经PBS漂洗35 min，100 mL/L封闭血清作用20 min，弃血清，加抗心肌肌钙蛋白T抗体（1∶100），4℃过夜. PBS漂洗35 min，加入二抗（生物素标记的羊抗小鼠试剂盒），37℃孵育45 min；PBS漂洗35 min，辣根标记的链霉卵白素37℃作用45 min. PBS漂洗35 min，DAB显色，自来水洗，细胞核苏木素衬染，二甲苯透明，封片. 用PBS代替一抗作为阴性对照.
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1.2.5.2 激光共聚焦观察Percoll分离后培养4 d的细胞经PBS漂洗2次，丙酮固定10 min，PBS漂洗35 min. 室温下用5 g/L TritonX100作用10 min，封闭血清处理20 min. 4℃条件下同一抗（抗a辅肌动蛋白，1∶800，Sigma）作用过夜，PBS漂洗35 min，与FITC标记的二抗（抗大鼠IgG, 1∶50，）室温下作用45 min，PBS漂洗35 min，然后用TRITC标记的phalloidin(50 mg/L，Sigma)在室温下与样本作用40 min，以显示肌动蛋白.PBS漂洗35 min，Hoechst33258染核15 min，PBS漂洗35 min.用900 g/L的甘油PBS溶液支撑盖玻片，激光共聚焦显微镜观察.( |# `1 ]3 P" E2 q) f
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2结果8 w1 ~5 \( R" v5 d: i# F
$ _: _: W; P% t$ k 2.1单个心肌细胞的培养和形态学观察未贴壁的细胞呈球形或椭圆形，培养2～3 h后细胞开始贴壁生长，24 h后细胞基本贴壁，少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动，搏动的频率、节律不同，呈圆形，梭形，三角形、多边形等形态；第3日时贴壁的心肌细胞逐渐形成细胞簇或细胞单层，跳动的细胞明显增多，跳动节律不同；第7日时细胞伸出的伪足已相互接触，呈放射状排列的同心圆状，搏动呈同步性，收缩明显而有力，形成功能性合胞体细胞（图1）.
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2.2单个心肌细胞的鉴定
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: z/ p& B8 v; \. W7 @. ~3 F 细胞贴壁培养3 d后行肌钙蛋白T免疫组织化学染色发现，细胞呈阳性（图2）. 在激光共聚焦显微镜下观察，αsarcomeric actin显示红色，αactinin 显示绿色，核为蓝色. 叠加后，可显示心肌细胞中形成红绿相间的肌原纤维（图3）.
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3讨论4 j) L2 r( V5 D' d5 d
3 `3 `, _# Q& r7 G/ ]. d3 J 1981年，小鼠ESC的成功分离、建系揭开了干细胞研究的序幕［5］. 继之，ESC定向诱导分化研究成为国内外研究人员共同关注的热点之一. Percoll是一种表面被聚乙酰胺吡咯烷酮包被的硅胶颗粒.该密度梯度分离剂无毒、无刺激性，对细胞无吸附作用，产生的渗透压很小，因此在全部密度范围保持等张［6］.国内外研究人员应用Percoll成功地对多种细胞进行了分离，均取得良好分离效果［7-9］.我们采用胰酶、Dispase酶消化乳大鼠心室肌组织及分化的小鼠胚胎干细胞，经Percoll分离纯化后能获得单个心肌细胞.光镜下单个心肌细胞自发地有节律性地收缩，免疫组织化学染色和免疫荧光染色证实为心肌细胞.: ?, w5 S; e6 `; l) Z
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本实验结果表明，采用胰酶、Dispase酶消化乳大鼠心室肌组织及分化的小鼠胚胎干细胞，经Percoll分离纯化可获得形态、活力良好的单个心肌细胞.这些心肌细胞可以用于心肌细胞的发育、生理、病理、药理、毒理、能量代谢等研究，还可以作为心肌组织工程的种子细胞.* ]" i6 y8 M' ]
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发表于 2015-6-22 15:44
