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作者：陈为坚，李贵涛，罗狄鑫，陈锡然，陈造宏，武光勤，叶伟，李晶作者单位：广东省第二人民医院骨外科，中山大学附属第二医院，广州 510317 4 P0 K* Y( B: Q2 x
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0 M9 X5 @- m) z6 W: z R 【摘要】 目的］探索应用骨髓间质干细胞结合骨形态发生蛋白进行脊柱前路融合的方法。［方法］自髂骨抽取骨髓4 ml，在体外扩增出自体骨髓间质干细胞；对12只新西兰大白兔经前路腹膜外行腰椎间盘切除脊柱融合术。每只动物取3个脊柱节段随机接受4种移植方法：骨髓间质干细胞、骨形态发生蛋白和纤维蛋白胶（A组），骨髓间质干细胞和纤维蛋白胶（B组），骨形态发生蛋白和纤维蛋白胶（C组），纤维蛋白胶（D组）。实验动物在术后3个月处死，利用放射学和组织学方法观察、分析脊柱融合情况。［结果］A组的椎间隙骨痂形成明显较其他组多，组织学上有连续的骨痂形成；B组和C组显示出近似的放射学和组织学变化，有不连续骨痂生成。D组融合效果最差，为纤维肉芽组织填充椎间隙，无骨痂生成。［结论］自体骨髓基质干细胞、纤维蛋白和骨形态发生蛋白复合体在移植入体内3个月后有良好的成骨并初步获得椎体间融合。
8 F! U4 p* }' Y9 Y 【关键词】骨髓间质干细胞； 骨形态发生蛋白； 脊柱融合术9 h+ p/ V4 X( N" V9 N `% v* x
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) C3 Q7 s1 Q9 V7 V5 @" | 脊柱融合术常用于治疗脊柱退变性疾病、椎体滑脱、脊柱畸形等临床多发病。融合的材料多数用自体骨、异体骨和人工骨。这些植入物体积大，须破坏较多的机体组织以获得良好的手术暴露，而且并发症多、费用高。因此开发具有良好生物学活性的可注射式植骨替代材料，改开放手术为微创手术是临床研究的热点。研究表明骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）经骨形态发生蛋白诱导可分化成骨细胞，作者探讨应用骨髓基质干细胞、牛骨形态发生蛋白（bovine bone morphogenic protein,bBMP）与纤维蛋白胶（fibrin glue，FG）的混合物作为骨移植材料，通过与单纯使用纤维蛋白胶、bBMP和MSCs比较来评价这种移植材料的成骨效果，以期为微创手术下行椎间融合提供参考〔1、2〕。 J4 ]: X# C ?# k7 V& m
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1材料与方法5 [5 A; G9 }+ u' T/ w
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1.1主要试剂和仪器
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新西兰大白兔购自中山大学医学院动物实验中心；胎牛血清（FBS）、DMEM培养基、及胰蛋白酶购自美国Gibco公司；纤维蛋白原、凝血酶抑肽酶（哈尔滨翰邦医疗科技有限公司），无菌液态bBMP（广州陆军总院提供）。$ j7 `6 M3 K3 ~0 \3 [2 D0 O, W
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1.2方法
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. |, O) k, }" ?7 Y2 S6 K; k' _7 X （1）兔骨髓基质干细胞的培养：健康10周龄新西兰大白兔12只，雌雄不限，各兔耳朵打孔标志，自胫骨粗隆处抽取骨髓4 ml，加入DHanks液摇匀，细胞悬液按1∶1.5比例加到细胞分离液上层进行密度梯度离心（2 500 r/min，20 min）。小心吸取富含有核细胞的中间细胞层（富含骨髓基质细胞），以DHanks液吹打洗涤细胞离心清除分离液后，分3份加入含有DMEM培养液（含20%胎牛血清、10 mg／L谷胺酰胺）的细胞培养瓶中分别培养，7 d后换液，后每3 d换液1次，直至贴壁细胞铺满整个培养孔的底面。用0.25％胰酶消化传代，并作细胞计数。1 ]' ?' a! C5 s( V* b
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4 S$ g$ }& v" a1 q0 z （2）bBMP与FG复合载体的制备：无菌操作下在纤维蛋白胶的抑胰肽酶溶液内分别加入液态bBMP，混合纤维蛋白胶溶液各成分聚合为FG，最终bBMP的浓度为20 mg／ml，将FG注射入12支无菌离心管中，4 ℃冰箱保存〔3〕；另取24支离心管分别注入FG，4 ℃冰箱保存。
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. Q" E: V* `4 w) _7 z' l6 v1 K （3）MSCs与FG复合物的制备：FG于紫外线下照射消毒1 h，分别加入各兔上述培养的传代3次以内的MSCs悬液，混匀,标志。将细胞离心后，去上清，使其悬浮于胶原bBMPDMEM混合液和胶原DMEM中，调整细胞终浓度约为5106/mL。
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（4）手术方法：新西兰大白兔体重约1.5～2.5 kg。用氯胺酮行静脉麻醉后，无菌操作下，在左侧腰大肌前缘做1个长约10 cm纵切口，腹膜后钝性分离暴露横突，沿横突前方推开腰大肌与腹膜，横突后方推开椎旁肌达横突根部，咬断横突，可见L3、4、L4、5、L5、6椎间盘和相应的椎体。锐刀从侧方切开椎间盘纤维环，并保留椎间盘前后纤维环。利用刮匙刮出椎间盘和部分软骨终板，梭形小磨钻打磨去软骨终板，至显露骨性终板，刮匙探查椎间盘见无软骨和髓核残留。用椎间盘撑开器撑开椎间隙，在L3～6 3个椎间隙中分别随机注射入4种FG凝胶中的3种，（所移植的细胞为各兔自体细胞），松开间盘撑开器将植入物自然溢出椎间盘外，纱布拭去溢出外面之蛋白胶。每盘约可注射凝胶0.08～0.1 ml。彻底止血后逐层缝合手术切口。术后，肌注青霉素40万U，2次／d，连续3 d，笼养，常规饮食，不限制活动。/ S; ]/ m" _2 \5 d: t0 ]; U; j
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（5）X线片检查和组织学观察：术后即时、术后3个月摄正、侧位X线片检查，3个月时加拍极度前屈后伸位X线片；于12周时处死动物，沿椎体边缘切取椎间盘内组织块，常规HE染色，光镜下观察。
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0 r2 U: E7 Y# n9 |- `& M （6）统计学方法：数据用x-±s来表示,用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，用ANOVA分析比较4组试验数值之间有无差异，P＜0.05为差异有显著性意义。3 \/ S# N0 ]5 X- ?
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2结果
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2.1培养细胞形态学特征
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; v/ N8 O. s' X# U* Z4 z2 ^ 培养细胞在平板上生长，接种12 h后即可贴壁，第2 d细胞成梭形，但较短粗，形似成纤维细胞。4 d时细胞的形态为梭形、多角形，细胞伸出细长的突起，生长活跃，7～8 d就基本铺满瓶底，排列无规律。传代后的细胞在24 h内贴壁,贴壁细胞很快铺展,呈簇状分布,较原代细胞体积变大,呈不规则的多角形,有短而薄的胞质突起，细胞核圆形或椭圆形。8 w$ ]6 {5 w; z7 M/ F
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2.2动物组织学观察! z. p6 q2 E+ M: t6 y9 @9 p
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8 Q3 Q7 C1 E5 N9 ?! Z; T+ P8 _3 ^3 P 术后12周时A组组织块内出现了大量的编织骨，网状骨小梁，新生骨组织连接前纵韧带后方的上下终板之间，近椎间盘中心也有少量骨痂形成。B组和C组可见前纵韧带后方有编织骨形成，骨量少，不连续。D组见纤维组织增生及少量成骨细胞，未见新骨形成。各组均未见纤维蛋白胶残留，椎间盘中有少量椎间盘髓核残余、中间有少量软骨组织形成（图1～3）。
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% ^' o) E1 E% K! Y; ]% b$ Y! o- h 2.3影像学结果
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. V. u/ ]( n) W- z& Y 第12周时X线片检查结果各兔均未造成椎体后缘增生，无椎管狭窄，经ANOVA分析和t检验，节段活动度A组与B组、C组差别有统计学意义（P＜0.05），B组与C组之间差别无统计学意义（P＞0.05）,B组、C组与D组之间差别有统计学意义（P＜0.05）；椎体后缘高度丢失统计结果显示A、B、C和D组组间差别无统计学意义（P＜0.05）（表1、2，图4）。8 M6 ^3 [& o& |( q
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表1第12周时节段活动度比较（略）
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) F3 i8 J: J( z5 F 经方差分析，A组和B组、C组差别有统计学意义（P＜0.05），B组与C组之间差别无统计学意义（P＞0.05），B组、C组和D组之间差别有统计学意义（P＜0.05）
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表2椎体后缘高度丢失（略）
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骨髓间质干细胞（MSC）是骨髓中的一种多功能细胞，具有自我增殖和多向分化的潜能，可诱导分化为成骨细胞。由于它取材方便，培养方法相对简单，已经广泛的作为种子细胞用于骨折和骨缺损的修复和重建，也有报道用于脊柱融合〔4〕。在实际应用中常常需要有促进细胞增殖和分化为骨细胞的生长因子和良好的生物材料支架。因此寻找合适的促骨生长因子和生物支架材料是骨组织工程的关键。 Q) h& Y# u5 e) W- t
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骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）是目前发现唯一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子。从牛骨中提取的BMP称牛骨形态发生蛋白（bBMP），其主要生物性作用是：（1）募集间充质细胞，并诱导其向成骨细胞或成软骨细胞方向分化；（2）协同其他调节因子参与骨组织形成。但bBMP促骨生长离不开种子细胞。这些种子细胞包括骨系细胞及骨髓基质中的干细胞，而且成纤维细胞、成肌细胞也可在BMP诱导下逆转分化为骨系细胞。Muschik等〔5〕将BMP注射入兔椎间关节，观察到可明显促进椎间关节融合。Minamide等〔6〕将一定量的BMP和Ⅰ型胶原结合作为载体，将一定量的MSCs吸附在载体上，用于兔脊柱后外侧融合，证明脊柱融合效果良好，然而这种融合多得益于周围的肌肉韧带等血供丰富的软组织提供大量的靶细胞，如间质干细胞，造血干细胞等。在前路椎间关节中，终板所能提供的血管床比后路少得多，血液中的种子细胞到达终板形成骨痂的时间大为增加，在以往的研究中常发现在血液丰富的纤维环及椎体前缘往往率先形成骨痂，可能与此有关〔4〕。本实验也发现应用BMP后形成的骨痂靠近前缘，椎体中心较少。而在应用BMP的同时应用MSCs，不但前缘可见骨化，椎体中心的新生骨组织也较丰富，效果优于前者。可能因为MSCs与BMP都有骨传导作用，两者一同应用于椎体融合可起到协同作用。' P8 [8 U8 q5 b+ s+ p- Q
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! R* |5 W5 B- Z+ `$ u* Z) N 图1A组3个月后，大量不规则成熟编织骨形成于前纵韧带后终板之间，近椎间盘中心也见大量骨痂形成，骨细胞大，基质丰富（略）
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图2B组和C组3个月后，纤维组织和骨痂生成，骨痂不连续，近前纵韧带一侧有大量成骨细胞，成骨活跃（略）3 V U" o( z! a1 ]1 A& L, y3 K
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图3D组3个月后，大量条索状纤维组织填充于椎间隙，其间见少量成骨细胞。分泌的骨基质极少（略）+ d. q: ^8 z. | o2 t9 c; x+ H5 X) l
5 r5 v7 j/ j8 U! ?! ] 图4影像学检查，箭头C（C组）和箭头B（B组）所示的骨痂于前纵韧带后方椎体前缘，椎体中心较少，有骨痂形成，但不连续。箭头A（A组）示不但前缘可见骨化，椎体中心的新生骨组织也比较丰富，上下终板有连续的骨痂生成（略）
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! U& ~* N! [- A$ y0 W1 q5 [ FG是在凝血反应的最后阶段形成的，此阶段纤维蛋白原与凝血酶结合成纤维蛋白单体，最后聚合成三维立体结构的FG。FG具有良好的细胞相容性、可塑性强的特点，是生物工程常用的载体。在体外复合培养MSCs与FG的实验中，发现MSCs可以在材料的表面生长，逐渐黏附，随着培养时间的延长，细胞长入孔隙内〔7〕。Schantz等〔8〕用FG作为成骨细胞的支架，体外培养后植入兔颅骨骨缺损的部位。术后X线和组织学检查表明骨缺损部位有新骨形成，未出现炎症与排斥反应。本实验中利用FG的三维立体结构作为BMP和MSCs的载体，避免BMP和MSCs被血液携带流失。而在12周后组织切片中未见到FG残留，提示其降解完全。而新生的骨组织又说明了FG不会影响MSCs的增殖和分化。
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本实验结果显示纤维蛋白胶复合BMP和MSCs组可在椎间关节形成骨性骨痂，融合效果好，3个月后在伸直屈曲位的活动性较其他组明显减少，在组织学方面评价也比其他组好。但所有的组别均出现椎间高度的丢失，可能系由于本实验中取出的椎间组织过多造成。由于人和兔椎体形状的差异，这种丢失在人体内是否会减少，还需进一步的实验证实。
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由于FG复合物质软，可直接注射入椎间隙，这便为临床微创手术下行椎间关节融合提供可能。然而在微创下去除大部分椎间盘和软骨终板绝非易事，因此结合新兴的一些微创手段，如激光、射频等通过汽化或烧灼清理局部组织的方法将为临床提供新的思路〔9〕。
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