干细胞支原体检测（实验记录）

nculsa747

1、        取1ml细胞培养液
% Y+ a0 z, f7 @( ~1 g1 e2、        若细胞较多可1000 rpm离心3 min以沉积细胞碎片1 l0 u& @9 j3 u8 M* Z% w
3、        取上清液13000rpm离心10min以沉淀支原体
$ Z5 i2 B2 a$ @7 R; S4、        倒去上清，保留少量液体后重悬
2 ~" }- j+ \# P$ H- \1 _" L: @5、95°C 煮沸15 min0 k* ]$ x" ?  `1 Q
6、取2μl液体作为模板
6 q; l. o8 [5 }/ Y$ P3 i
3 b8 ~, W$ e- S% B2 N模板        2μl6 V8 [+ g  e0 `+ F! ~
正反引物        2μl
" I! b  _3 ]5 m6 ?, h7 C1 C2×PCR MaterMix        12.5μl& v' W1 Y9 K$ `' z# F  Q9 j% c
ddH2O        8.5μl6 I5 x8 U/ Z. B
总体系        25μl
1 ^# g4 T  ^) [* d/ ^2 k' {8 F9 o' ?$ F$ m/ Y
反应条件如下：94度 10 min，94度 1 min，55度 30 s，72度 30 s，34个循环；72度 1 min。
! V+ P. q, e$ @% ~3 c) _% i
5 O+ [! G& d$ [# V* D7 L注：  1可以使用10μl的体系进行检测。& z# p  T" a* u+ l
      2支原体重悬液煮沸后放在4度存储，第二天又做的PCR，加模板时，发现呈胶胨状，42度10min也没有熔化，看样子只能采取两种方法：一是95度加热后立即进行PCR；二是95度重新熔化。（只所以呈胶胨状，可能与培养基中的血清等有关）: g5 S$ q5 b3 k  X9 C- @9 o
      3在支原体检测时，加了一个阳性对照（对照为之前检测呈支原体阳性的菌液），一个阴性对照（水）。另外，除了myc引物，还用了其它两个用于支原体检测的引物（好像是micro-test,micro-universal）& o; A  u( E8 u* s( Z$ g6 m
      4本次检测的是H9和HSF1两个细胞系是否感染支原体，加上正负对照，一个引物要做4个反应。三个引物的话，要做12个反应。取三个PCR管，每个管先加4X（正反引物＋水＋2XPCRMix），混匀后，再分装到4个反应管中，最后加模板。

wuxiao101325

谢谢分享！请问楼主如果没有阳性对照怎么办？我们是通过试剂公司要的阳性模板，但是快用完了，也不敢在细胞间养支原体：（

zhenhuale

很不错

nculsa747

回复 2# wuxiao101325
0 J3 E2 R5 J  o2 l
4 e% v' v6 q; r% P3 [# M, ~/ ?3 p- m
6 m; Z. X- a0 K5 v3 C# j8 V没有阳性对照？这个我就不太清楚了。呵呵，期待其它战友的回答。

sannia

热切希望楼主给出primer序列！多谢

nculsa747

回复 sannia 的帖子* F; P. |2 x6 f% J8 _% |0 y0 G. f

: C+ y& ~* B* p/ S+ i: EmycontestR tgcaccatctgtcactctgttaccctc
/ D$ u" N2 Z1 k! Q" ?' Z4 U2 cmycontestF gggagcaaacaggattagtatccct' g1 Y! k% @- y* q% Z: C

2 t4 Y3 ]) J& z
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( |6 w4 {$ E$ z& q0 S& lHPRT R        CACTAGGTAGCCGTGGGAATT! n' W5 S( d6 ^' [- R; u. ]" r
HPRT F        CGATGACTGGAACCCGAAGA

懵懂干细胞

好东西啊！

sannia

太感谢！

huozhicb

谢谢！！！

mbjane

谢谢分享！最近正在做支原体检测试验，用的是Applichem公司的A3744支原体检测试剂盒。请问有用过这个试剂盒的吗？我半年前做的时候阴阳对照都正常，但是这次做阳性对照出不来条带。期间有保存温度不合适，请问会是这个原因引起试剂盒失效了吗？