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作者：赵劲松 黄岚峰 苏冠方 刘早霞作者单位：吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 130041 7 A2 j' c( F/ I, L
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/ J1 I9 p" c! }* s4 Z 【摘要】 目的 探讨以骨髓间质干细胞（BMSCs）作为种子细胞，利用胶原涂层作为细胞载体，体外构建组织工程角膜的可行性。方法 将兔骨髓细胞悬液分离后，经过传代培养得到稳定的BMSCs，以1×106/ml种植于胶原涂层的6孔培养板中培养3、5、7 d，观察细胞形态学变化和膜形成状态，并进行组织学研究；对照组采用无胶原涂层的6孔培养板培养。结果 培养3 d，细胞长满培养板，并于周边部逐渐形成复层细胞区；培养5 d，复层细胞区面积逐渐增大，周边部开始收缩，并与培养板分离；培养7 d，细胞层与培养皿底部完全分开，形成完整的膜状结构，并具有一定强度。显微镜下观察培养7 d的BMSCs按照一定方向排列，HE染色见细胞呈复层生长，状态良好；对照组在培养7 d后见到细胞密度明显增加，但没有形成膜状结构。结论 利用BMSCs和胶原基质可以共同构建复层膜状细胞结构，其细胞排列有序并具有一定机械强度，可期望用于组织工程角膜的体外构建和角膜病变患者的眼表重建；但构建复合物的生物学功能和活性尚有待进一步研究。 ! G; l5 {% T$ F4 n& _! ~/ ~* Q. n- m
【关键词】组织工程 角膜 骨髓间质干细胞 体外构建 t7 E% f; ?" O/ q' Q8 L
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. n- A+ @% _( w" n* y 眼表疾病是眼科常见而多发的疾病，随病情发展常导致眼表瘢痕化、视力下降并可导致失明，在致盲性眼病中占据首位。尤其是老年患者，组织修复能力较差，严重影响生活质量。该病治疗方法多采用自体结膜移植，但往往面临较大的副损伤，并且修复效果不理想；异体角膜移植可获得较好的疗效，但因为异体角膜的来源非常有限，远远不能满足患者的治疗需求。随着组织工程技术的发展，各种人工组织相继出现，种子细胞、细胞因子、支架材料以及体外构建的研究为组织工程角膜的研究提供了参考。本研究着眼于组织工程角膜的体外构建，利用骨髓间质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）作为种子细胞，以I型胶原作为基质材料，利用胶原培养收缩的特性在体外构建膜状的具有复层细胞结构的人工角膜，并从形态学和方法学角度探讨其在组织工程角膜研究中应用的可行性。7 V& T/ R2 |: g
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1材料与方法6 d4 ^3 |1 v$ s! b/ q: f
5 C' q! @0 `& D8 ]1 X 1.1兔MSCs的培养; v( D! @& o9 V3 e: [2 \
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按照Friedenstein〔1〕的方法获得原代兔BMSCs，用含1%抗生素（Sigma）胎牛血清终浓度10%的DMEM 培养液（Gibco），在饱和湿度、体积分数为5%CO2孵箱内37℃培养。选取生长状态好的传3代的兔BMSCs作为种子细胞。
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1.2体外构建& }4 E1 F5 Y# m9 X4 j v
0 q9 ~. H, L6 p5 Z7 z9 ^- ` 实验组首先用浓度为1.0％的I型胶原溶液包被6孔培养板，并置于超净工作台中干燥备用。选取经3次传代培养后增殖旺盛的BMSCs，以1106/ml浓度植入6孔培养板中，首次半量更换培养液，每周换液2次，每天用倒置显微镜进行形态学观察并记录，分别培养3、5和7 d，然后对复合物进行HE染色，光镜下观察。对照组BMSCs在无胶原包被的6孔培养板中培养，其余与实验组相同。
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2结果
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! U+ s; b. G4 H+ S) f( G8 D2 V6 Y4 F2 D0 B原代BMSCs经过3次传代培养后增殖旺盛（图1）。实验组种植培养3 d后，细胞长满培养板，呈融合状态，并于周边部可以观察到逐渐形成的复层细胞区（图2）；培养5 d后，复层细胞区面积逐渐增大，周边部开始收缩，并与培养板分离，显微镜下BMSCs按照一定方向排列（图3）；培养7 d后，培养的细胞与培养皿底部完全分离，整体收缩，形成完整的膜状结构，并具有一定力学强度（图4）。HE染色见BMSCs呈复层，生长状态良好。对照组培养细胞3 d后与实验组相同均长满了培养板，但经过继续培养后，细胞密度逐渐增大，没有形成复层的细胞区域，7 d后亦没有形成膜状的结构（图5）。
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3讨论0 ?* ^' b( B; a$ Y; c: l
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组织工程种子细胞来源主要是构建组织本身具有增殖能力的细胞，或者自身组织和其他部位组织具有分化能力的干细胞；对于角膜而言，自身的细胞主要是角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞，来源于人眼的正常角膜，并以胎儿的角膜最佳〔2〕，但是这种最佳的来源在临床上受到很大的限制。研究证实角膜缘上皮细胞有干细胞存在，角膜上皮增生主要发生在角膜缘部，以角膜干细胞为源泉逐渐向中心移行，具有分化度低、生命周期长、高度增生潜能等特点，成为组织工程角膜研究中首选的种子细胞〔3〕。但是体外培养角膜缘干细胞仍然要来源于正常眼部组织，并且只有自身具有一定数量的组织才能够分离培养成功，仍然受到很大的限制。BMSCs最早被用于组织工程骨和软骨的研究，作为种子细胞可在不同诱导条件下体外构建组织工程骨、软骨和皮肤等多种组织，表现出了具有多种分化潜能的特性，由于其取材方便，无副损伤，而且来源充足，所以广泛应用于各种组织工程研究〔4〕。但在组织工程角膜的研究中，却很少报道。由于BMSCs经过培养后可表达I型胶原，这与占角膜组织结构9/10的基质细胞层的细胞功能相似，所以利用BMSCs作为组织工程角膜的种子细胞可作为一种尝试。) y: d/ c7 J# ]. M( x
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2 w/ F) _" L( _- D5 U" ` 与其他组织工程研究不同，角膜的基质材料要求具有良好的透光性和柔软度，而且体外构建的复合物要具有膜状结构，便于移植。理想的角膜基质材料应具备下列特点:①良好的生物相容性；② 良好的组织引导性；③良好的生物降解性；④良好的可塑性；⑤良好的机械强度和可操作性〔2〕。5 {! Q0 g6 `) B5 ]" u, [# J
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动物胶原在体外经过酶解或酸解、提纯、分型处理后，存在的抗原性物质可被除去。大量的研究结果表明，动物提取的胶原免疫原性低、组织相容性好，可引导角膜细胞黏附和生长，参与受损角膜组织的重建，其降解产物小链段多肽蛋白质和氨基酸可作为组织细胞的营养成分。胶原可从动物中大量提取，来源丰富且价格便宜，因此胶原可作为人工角膜基质材料〔5〕。本研究中利用动物来源的Ⅰ型胶原作为培养板的涂层，种植细胞7 d后包被的涂层与BMSCs一同分离，其中胶原涂层作为连接细胞的基质载体使复层细胞形成完整膜状结构，并具有一定的机械强度，可用于角膜组织工程的研究。
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% |9 F4 O! U) P本研究证实该方法可以将种子细胞和透明的胶原基质有机地结合为一个整体，构建的膜状物具有整齐的细胞排列，具有一定的机械强度和可操作性，该方法适用于角膜组织工程的体外构建。但构建复合物的生物学活性尚有待深入研究。
1 |; i! V+ X6 D# M9 r# H 【参考文献】' r+ b! }6 u# z. I6 b# g
1 Friedenstein AJ，Chailakhyan RK，Gerasimov UV.Bone marrow osteogenic stem cells:in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers〔J〕.Cell Tissue Kinet (England),1987；20(3)：26372.6 Q' O; b( `" x+ o9 p2 z, k# n
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' ]! r& t% R5 ~0 U3 v; @! D2 L 2 李沁华.角膜组织工程的研究进展〔J〕.中国修复重建外科杂,2004；18(3):22931.
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: y# c5 ~$ k+ L2 S 3 Nishida K，Yamato M，Hayashida Y,et al.Corneal reconstruction with tissueengineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium〔J〕.N Engl J Med，2004；351(12):11702.
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4 Tae SK，Lee SH，Park JS,et al.Mesenchymal stem cells for tissue engineering and regenerative medicine〔J〕.Biomed Mater，2006；1(2):6371.
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发表于 2009-3-3 12:34
发表于 2015-5-23 15:19
